1、木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、 研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。二、 木瓜蛋白酶基本介绍： 木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根
2、、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几
3、乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值67(一般39.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度5565(一般1085皆可)，耐热性强，在90时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占
4、可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用，是一类巯基蛋白酶, 广泛地存在于番木瓜的茎叶和果实中, 未成熟的乳汁中含量最高.因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强, 对多种蛋白质均具有很好的降解作用, 目前已被广泛应用于各个行业.在食品中, 木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中.由于此酶为纯天然产物, 其开发前景广阔.运用蛋白质分离纯化的一般方法可将其制备出来并进行活力鉴定。三、 木瓜蛋白酶的提取1、过去的常规提取方法（1）、烘干法：在番木瓜浆液中加入保护剂，然后
5、将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在5560烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16105U/g，且产品的纯度较低。（2）单宁沉淀法：乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。2、目前较为常见的提取方法（1）、超滤法：谭晶等用超滤技术分离木瓜
6、蛋白酶。先将中空纤维超滤膜洗净，经过处理后，控制一定压力和流量，进行超滤。木瓜蛋白酶是大分子物质，在超滤过程中被截留，而水及小分子杂质透过膜，从而达到分离和纯化的目的。实验结果表明，超滤后木瓜蛋白酶的活力是超滤前的1.22倍，蛋白质含量为超滤前的2.8倍，说明超滤后木瓜蛋白酶的纯度有所增加。但由于木瓜蛋白酶属于大分子物质，在超滤过程中会在膜表面聚积而产生浓差极化现象，使超滤速率逐渐下降影响酶得率。（2）、盐析法：王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析，然后调pH值，离心取沉淀，干燥，得酶产品。实验结果表明，用该法制备的木瓜蛋白酶纯度相对较高，酶的比活
7、力达到了1184U/mg，适宜作为化妆品成分。但这种方法由于用了大量的盐，使酶中灰分增加，同时降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，盐析法并不是理想的木瓜蛋白酶提取方法。（3）、絮凝法：絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物，从而使酶从溶液中沉淀析出。何继芹等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白酶。实验结果表明，在适宜的条件下进行絮凝处理，可使木瓜蛋白酶在这步的收率达9597%。但这种方法提取专一性不强，制得的木瓜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高。（4）、超声波法：超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取。超声波产生的空化效应，一方
8、面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输，另一方面破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放，从而强化了提取过程。超声波形成的微射流效应也是提高提取率的一个重要原因。肖贵平曾用超声波法提取木瓜蛋白酶。选择新鲜的番木瓜，清洗后切块破碎，称取果肉，打浆；果浆在一定条件下进行超声波处理，离心、除杂、过滤后，上清液进行超滤浓缩，收集酶液样品。结果表明：超声功率300W，超声时间200s，果浆质量分数30%，这时酶活力是未经超声波处理的1.71倍。采用超声波提取工艺得到的粗酶液的含量较低，含有较多杂质，经膜分离初步纯化浓缩后，还需作进一步纯化处理，这有待于进一步深入研究，以提高酶的活性和纯度。 （
9、5）、亲和膜色谱法：亲和膜色谱技术是一种20世纪80年代末发展起来的生物大分子分离纯化的新技术，把膜分离与亲和分离结合起来，使之兼具膜分离与亲和分离的特点。聂华丽等以尼龙膜为基质，键合壳聚糖进行表面改性处理，以降低尼龙膜的非特异性吸附，并偶联染料配体Cibacron Blue F3GA，得到一种新型的亲和膜色谱材料，并用其对木瓜蛋白酶进行分离。结果表明，该亲和膜具有良好的色谱性能，对木瓜蛋白酶有较高的吸附量（235.3mg/g），使用该亲和膜对木瓜粉中的木瓜蛋白酶进行分离纯化，纯化倍数可达46.5倍。亲和膜色谱与传统的膜分离、亲和色谱相比，不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、生物大分子在分
10、离过程中变性机率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离。 （6）、双水相萃取：双水相萃取是利用物质在不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。Sarote N等人用双水相法提取了木瓜蛋白酶，结果表明，用8%的聚乙二醇和15%的硫酸铵组成的双水相体系对木瓜蛋白酶的提取效果最好，酶的比活力可达1659U/mg，收率为86.2%。双水相萃取具有目标产物收率高、易于连续化操作、不存在有机溶剂残留、分离过程经济等优点，在木瓜蛋白酶的制备中应有一席之地，但我国目前尚无这类报道。随着木瓜蛋白酶应用的不断开发，对木瓜蛋白酶的纯度要求也越来越高。因此迫切需要特异性更大的制备木瓜
11、蛋白酶的方法。开发双水相萃取技术，作为有效的高纯度木瓜蛋白酶的分离提取方法，是很有意义的。四、木瓜蛋白酶在食品工业中的应用：1、作为肉类嫩化剂：老龄畜禽肉煮熟后，口感粗糙、坚硬，而加入嫩肉粉后，肉质就会变的松软、嫩化。嫩肉粉的主要成分之一是木瓜蛋白酶，一方面因为木瓜蛋白酶是一种半胱氨酰基蛋白酶，能降解肌原纤维和结缔组织的蛋白酶。它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成小分子的多肽甚至氨基酸，令其肌丝和筋腱丝断裂，使肉类变得嫩滑爽脆，从而使肉类蛋白质因结构简化而易于消化吸收；另一方面，由于嫩化剂比较充分的发挥作用是在肉品被蒸煮的期间，温度较高，而木瓜蛋白酶最适合温度5560，热稳定性强，在90时也不会完全
12、失活，因此常用于生产嫩肉粉。雷昌贵等人以新鲜牛肉为原料，研究了木瓜蛋白酶对牛肉肌原纤维小片化指数（MFI）及剪切力的影响，结果表明浓度为0.007%的木瓜蛋白酶溶液对牛肉的嫩化效果最佳，主要是由于木瓜蛋白酶促进Z线的裂解，使肌原纤维小片化指数（MFI）发生显著性增加，剪切力随着贮藏时间的延长显著降低。B.M. Naveena等人曾研究了各类植物蛋白酶对水牛肉的嫩化作用，结果表明，利用木瓜蛋白酶处理过的水牛肉，其肌原纤维蛋白溶解度显著增加，剪切力值显著减少。木瓜蛋白酶由于其良好的蛋白水解能力，可将其用于多方面。在海洋捕捞中低值鱼和小杂鱼占有很大的比例，如不好好利用就会造成很大的浪费，我们可以利用
13、木瓜蛋白酶生产浓缩水解蛋白，而且这样得到的蛋白优于整鱼肉或鱼蛋白浓缩物，具有水溶性好、低脂、低灰分、高蛋白等特点。木瓜蛋白酶还可以用于由于阻止食品的褐变，回收屠宰的动物骨头中残存的碎肉等。2、作为啤酒品质改良剂：主要用于改良啤酒品质。木瓜蛋白酶能水解啤酒内的蛋白质，部分水解一些已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度，同时改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例，有效地改良啤酒品质。据报道，对冷冻贮存过程中的啤酒加入浓度为0.08mg/100mL的木瓜蛋白酶时澄清效果最佳，能提高游离氨基酸含量，可使浑浊度降低68.75%，游离氨基酸苏氨酸、缬氨酸和精氨酸分别增加
14、了8.2倍、0.2倍和1.1倍。3、作为饼干松化剂：在饼干、糕点中使用木瓜蛋白酶可以通过破坏巯基，降低面团筋度、提高饼干疏松度，使其成型性好，饼色油润，减少次品率、提高成品率；此外还可减少油脂和糖的用量。适用于各种风味的高、中、低档饼干、糕点及面包的制造。4、用于调味品生产：啤酒酵母菌是啤酒工业的一个附产物，通过木瓜蛋白酶分解而提取香味浓郁的酵母抽提物，经调味后可制得酵母调味酱，它作为一种优良的调味品提高了酵母菌的价值和利用率。5、用于营养保健品工业：木瓜蛋白酶用于保健食品主要有两种途径：一种途径是辅助消化，可做成肠溶片，口服以达到消除消化紊乱的目的；另一种途径是将一些含有特殊蛋白源的动植物分
15、解制成各种营养保健液。方富永等采用木瓜蛋白酶酶解巴非蛤贝肉，结果表明酶解液中游离氨基酸含量丰富，约为923.0mg/100ml（色氨酸未计），其中必需氨基酸占33.0%。巴非蛤贝肉经复合蛋白酶水解，适当调配可制作营养丰富、海鲜风味浓郁、具有一定保健功能的口服液。3.6用于宠物食品生产用木瓜蛋白酶对宠物食品进行处理，可以减少宠物食品的黏稠性，改善口感，增加风味。由于木瓜蛋白酶还具有驱虫效果，也可以用番木瓜汁来驱除哺乳动物宿主肠道内的线虫。另外，木瓜蛋白酶还可以应用到化工、医药等领域。如洗衣粉等洗涤剂中加入木瓜蛋白酶能快速地清洗衣物中的血渍和汗渍。此外，木瓜蛋白酶还可以促进中药成分的有效煎出，用于辅助Rh血型的鉴定，还可用于肿瘤的辅助治疗等。目前，木瓜蛋白酶被广泛地应用于食品行业，如肉类、啤酒、调味品等的生产。随着我国人民生活水平的提高，人们对食品安全和食品营养的问题越来越关注，而木瓜蛋白酶可用来生产安全、营养的食品，如具有保健功能的口服液等，具有良好的市场前景。同时，为了满足各行各业对木瓜蛋白酶的需求，尤其是食品与医药行业，研究如何分离纯化得到成本低、纯度高的木瓜蛋白酶就很有意义。因此，对木瓜蛋白酶的提取和分离纯化技术进行深入的研究，提取高质量的木瓜蛋白酶具有重要的实用价值。实验内容： 一、实验目的：1
