1、流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养:取对数生长期的细胞,按1106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。2. 细胞固定:800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4固定4h以上。3. 细胞染色:1500rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ul RNase A(100ug/mL ),4避光孵育30min。4. 流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数23万个细胞,结果用细胞
2、周期拟和软件ModFit分析。注:上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞!因为PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团!流式细胞周期结果图解读 1、纵坐标Cell Number:即计数的有效细胞数;2、横坐标DNA Content:即DNA含量;3、G1、G2、S三期在图中已经标示;4、右侧数字含义:Dip G1-53.84% at 55.56,即G1期DNA含量平均值为55.56;53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%;Dip G2-5.64% at 107.72,即G2期DNA含量平均值为107.72,5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%;以此类推 流式细胞周期结
3、果图的意义,主要从细胞周期的角度看各参数的意义:1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程,所需的时间叫细胞周期时间。1、细胞周期可分为四个阶段: G1期(gap1),指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间; S期(synthesis phase),指DNA复制的时期; G2期(gap2),指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间; M期又称D期(mitosis or division),细胞分裂开始到结束。2、从增殖的角度来看,可将高等动物的细胞分为三类:连续分裂细胞,在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞,如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。休眠细胞暂不分裂,但在适
4、当的刺激下可重新进入细胞周期,称G0期细胞,如淋巴细胞、肝、肾细胞等。不分裂细胞,指不可逆地脱离细胞周期,不再分裂的细胞,又称终端细胞,如神经、肌肉、多形核细胞等等。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关,如:小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时,人类胃上皮细胞24小时,骨髓细胞18小时,培养的人成纤维细胞18小时,CHO细胞14小时,HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同,是造成细胞周期差异的主要原因。3、流式细胞结果图各参数的意义:常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量(横坐标)来分析的:G1期:DNA复制还没开始,也是DNA含量最少的,即流式检测结果图的第一个峰;S期:DNA开始复制,到完成复制,是一个一倍DNA到二倍DNA的过程,在流式结果图中显示期跨度特别大(第二个不高但很宽的峰);G2期:DNA复制完成至分裂的一段时间,此时细胞内含二倍DNA,在流式结果图中的第三个峰;M期:细胞分裂过程,此时细胞内也是二倍DNA,用DNA含量的方法是无法与G2期分开,所以有第三峰明显升高时报告:G2/M期阻滞。