1、猪病诊断技术规范一、致病性大肠杆菌的检测1 引用标准参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。2 范围适用于猪大肠杆菌病的诊断。3 检测方法3.1 材料3.1.1 营养肉汤3.1.2 营养琼脂3.1.3 EMB3.1.4 TSI3.1.5 IMViC生化鉴定管3.1.6 小白鼠3.2 分离培养a) 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 培养1824 h。b) 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。c) 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取510
2、个典型菌落再接种于TSI琼脂。d) 同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37 培养1618 h的菌液用于生化特性鉴定。3.3 生化鉴定挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(361) 培养24 h后观察结果。3.3.1 靛基质试验：a) 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。3.3.2 甲基红（MR）试验a) 滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。b) 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。3.3.3 VP试验a) 滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀
3、，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。b) 在15 min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。3.3.4 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。3.4 大肠杆菌鉴定结果应符合表1要求。表1 大肠杆菌鉴定结果靛基质MRVP枸橼酸盐鉴定+-典型大肠埃希氏杆菌-+-非典型大肠埃希氏杆菌+-+典型柠檬酸盐杆菌-+-+非典型柠檬酸盐杆菌-+典型产气杆菌+-+非典型产气杆菌出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验
4、。3.4 致病性试验a) 取经营养肉汤37 培养1618 h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种23只，每只0.3 mL（含菌量约为11012 cfumL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。b) 饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。4 药敏试验a) 挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37 培养1618 h，菌液用于药敏试验。b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1109 cfumL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片25
5、张，置37 培养24 后观察。c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。二、沙门氏菌的检测1 引用标准 参考NY/T 550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。2 范围适用于猪沙门氏菌病的诊断。3 检测方法3.1 材料3.1.1 SC3.1.2 DHL3.1.3 TSI3.1.4 赖氨酸脱羧酶（LD）3.1.5 邻-硝基酚-D-半乳糖苷（DNPG）3.1.6 甘露醇糖发酵管3.2分离培养a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。b) 无菌剪取肝、脾样品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10 mL增菌液），361 培养1824
6、h。c) 取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，361 培养1824 h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。3.3 生化鉴定a) 挑取DHL平板上可疑菌落35个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。b) 再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，361 培养1824 h（挑取菌落后的平板，应置于4 冰箱保留48 h以备复查）。c) 按表1记录反应结果，对照
7、表2进行判定。d) 凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。表1 生化反应结果判定生化管TSILDONPGMAN底a斜面b硫化氢第一次颜色记录符合黄+黄+黑+紫+深黄+黄+第二次颜色记录符号红-红-无黑色-黄-无色或淡黄-紫-a “底”观察葡萄糖反应。b “斜面”观察乳糖和蔗糖反应。表2 生化检测沙门氏菌属判定表序号TSILDONPGMAN判定底斜面硫化氢ABaCDbEcFdG+-+-+-+-+-+-+-+-+-沙门氏菌亚种、沙门氏菌亚种b、15a沙门氏菌亚种a、15b、15少数沙门氏菌亚种少数沙门氏菌亚种甲型副伤寒沙门氏菌非沙门氏菌a含1硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中
8、大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。c 硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。d可直接用（O）单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。4 药敏试验a) 挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，361 培养1618 h，菌液用于药敏试验。b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1109 cfumL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片25张，置361 培养24 后观察。c) 根据
9、抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。三、产气荚膜梭菌的检测1 引用标准 自定标准。2 范围适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。3 材料3.1 绵羊血琼脂3.2 牛乳培养基。4 组织染色镜检对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。5 分离培养可将肠道内容物接种血平板，37 厌氧培养1824 h后观察。菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径25 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。6 生化鉴定对牛乳培养基的“暴烈发酵”。
10、7 肠内毒素检查采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 30min）。两份上清液分别静脉注射家兔（13ml）或小鼠（0.10.3ml）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。8 报告因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。四、猪痢疾诊断1 引用标准参考NY/T 545-2002。2 范围适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。3 粪便中Sh显微镜检查3.1
11、材料3.1.1 器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等3.1.2 染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。3.1.3 样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠内容物及黏膜3.2 操作方法3.2.1 染色样品制作：取样品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2结晶紫液或稀释复红染色2 min3 min，水洗，吸干后待检。3.2.3 悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。每份样品最少制片2张3.2.4 显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野4001000倍镜头下观察。3.3 结果判定典型Sh菌体长6 m8.5 m，呈25个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。当视野中有
12、数量（35条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。4 分离培养和鉴定4.1 材料准备4.1.1 器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65 m滤膜。4.1.2 试验动物：小鼠（20 g左右）4.1.3 试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。4.1.4 样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液）。对死猪或扑杀猪大肠分段结扎（每段10cm），分离取出。样品应尽早分离培养，也可04 保存47 d。4.2 操作方法4.2.1 样品种Sh镜检将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者
13、，则难以分离成功。4.2.2 分离培养4.2.2.1 直接划线分离法：即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。4.2.2.2 集菌法：先将样品以生理盐水或PBS作1：5稀释，2000 r/min，弃去沉淀。将上清液再以60008000 r/min离心20 min。取沉淀划线接种TSA若干皿。4.2.2.3 稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10-610-8。取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSA上，（每梯度稀释液最少接种3皿）。接种后的培养皿置厌氧罐内进行厌氧培养。若上述稀释液中加入多粘菌素200 U/mL300 U/mL，可提高分离率。4.3 结果判定4.3.1 观察每隔24
14、 d开罐检查一次，共24次，观察有无溶血区及溶血菌落。致病性Sh呈强溶血，一般看不见菌落。当培养条件适宜时，再溶血区可见到云雾状菌苔。无害蛇样螺旋体等呈弱溶血。4.3.2 移植纯化先作溶血区内物质涂片，染色镜检。如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区内移取小块琼脂划线于TSA若干皿。如此每隔2天移植一次，一般24次后即可纯化和保存。4.3.3猪蛇样螺旋体鉴定4.3.3.1 溶血试验将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区内，经48 h培养后，观察比较其溶血程度。4.3.3.2 肠致病性试验每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌35亿），次日再灌服一次，15 d后剖检观察盲肠病变。感染后50出现腹泻和病变者，则为致病性Sh。五、猪巴氏杆菌病诊断技术1 引用标准参考NY/T 564-2002。2 范围适用于猪巴氏
