1、1、 外周血单个核细胞Ficoll分离：向Ficoll分层液离心管中加入稀释的血液样本，1500rpm，5min离心机离心；i用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中，将所得的单个核细胞悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-1640洗涤2次，1500rpm，5min；用细胞计数仪或血球计数板计数细胞，调整细胞至所需浓度；淋巴细胞浓度浓度（细胞数/mL）=四个大方格内细胞数/41042、 细胞冻存：（1）配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液；（2） 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至
2、15ml离心管中、；（3）离心1000rpm，5min；（4）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml；（5） 将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml；（6）在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-80冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。3、细胞复苏：（1）从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温
3、水中，并不时摇动令其尽快融化。（2）从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；（3）离心， 1000rpm，5min；（4）弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；（5）次日更换一次培养液，继续培养。4、注意事项：（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；（2）将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；（3）冻存和复苏最好用新配制的培养液。（4）细胞分层液应避光4下保存，取出后逐渐升至室温后
4、混匀，方可使用，避免细菌污染。（5）稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞售货量，但是如果要保留血浆成分作为其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。5、所需材料：（1）仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4、-20、-80）、倒置相差显微镜、 培养箱、液氮冰箱（2）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸（3）塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、 移液管（10ml）、15ml离心管、 冻存管（12ml）其他物品：微量加样枪、 红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪（5）试剂:D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
