1、细胞核与线粒体的分级分离细胞核与线粒体的分级分离 1.1.初步了解细胞内各种成分的分离方法初步了解细胞内各种成分的分离方法 2 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法分离方法 3 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。性鉴定。一、实验目的一、实验目的 细胞器分离基本步骤细胞器分离基本步骤 二、实验原理二、实验原理 细胞破碎细胞破碎 分离、纯化分离、纯化 细胞器鉴定细胞器鉴定 （一）细胞破碎的方法（一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂介法 5.反复冻融法 二、实验
2、原理二、实验原理 细胞破碎的注意事项：细胞破碎的注意事项：1 1、匀浆介质：、匀浆介质：常用介质是缓冲的常用介质是缓冲的蔗糖水溶液蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具有足。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2pH7.2-7.47.4的条件下细胞器不易发生聚集。的条件下细胞器不易发生聚集。2 2、尽可能在低温、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。条件下进行，避免酶失活。3 3、若是采用、若是采用低渗方式低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越
3、好，通常从开始收获细胞到匀浆结中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过束不要超过5 5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。（二）分离纯化的方法（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，异，离心离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术技术 离心离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩
4、和提纯的一系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法种方法 主要包括主要包括差速离心、密度梯度离心差速离心、密度梯度离心等方法。等方法。二、实验原理二、实验原理 差速离心法 根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级分级增加离心力增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法从试样中依次分离出不同组分的方法。从从低速到高速逐级沉淀分离低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差一般用于分离沉降系数相差较大较大（10倍及以上倍及以上）的颗粒的颗粒。优点优点是：操作简单是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉离心后用倾倒法即可将上清液与
5、沉淀分开淀分开，并可使用容量较大的角式转子并可使用容量较大的角式转子。缺点缺点是：是：分离效果差分离效果差，不能一次得到纯颗粒；不能一次得到纯颗粒；须经反须经反复悬浮和离心加以纯化复悬浮和离心加以纯化。壁效应严重壁效应严重，特别是当颗粒特别是当颗粒很大或浓度很高时很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；在离心管一侧会出现沉淀；颗粒颗粒被挤压被挤压，离心力过大离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形离心时间过长会使颗粒变形、聚聚集而失活集而失活。密度梯度离心 下次课讲（三）细胞器的鉴定分析（三）细胞器的鉴定分析 分析分级分离得到的组分，可用分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法细胞化学和生
6、化方法进行形态和功能鉴定进行形态和功能鉴定。细胞器标记酶细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶，该酶使使詹纳斯绿詹纳斯绿B B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗丹明丹明123123或或MitoTrackerMitoTracker等荧光探针标记法等）等荧光探针标记法等）细胞核：细胞核：DNADNA亚甲基蓝、甲苯胺蓝
7、、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、HoechstHoechst染料等染料等 方法和步骤方法和步骤（一）细胞核的分离提取（一）细胞核的分离提取 1、肝脏肝脏，剪成小块剪成小块(去除结缔组织去除结缔组织)尽快置于尽快置于盛有盛有0.9NaCl的烧杯中，反复的烧杯中，反复洗涤洗涤，尽量除去血，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。污，用滤纸吸去表面的液体。2、称取肝组织、称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖蔗糖-0.05molL Tris-HCI缓冲液，缓冲液，pH7.4（0.25moll蔗糖蔗糖0.003moll氯化钙）溶液洗氯化钙）溶液洗涤数次。涤数次。3、按每克肝加、按每克
8、肝加8ml-9ml预冷的预冷的0.25molL蔗糖蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液，用溶液，用高速组织匀浆高速组织匀浆器器匀浆（已完成）匀浆（已完成）4、取一定量匀浆液，在、取一定量匀浆液，在04冰浴中用冰浴中用玻璃匀浆器玻璃匀浆器将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有冰块冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨）插入管中，上下转动研磨）（因已事先匀浆，（因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短）本步骤研磨次数和时间可缩短）5、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂涂
9、片片,自然干燥自然干燥.6 6、滤液以、滤液以2500rpm2500rpm，离心，离心1515分钟；分钟；(1)(1)缓缓取缓缓取上清液上清液，移入高速离心管中，保存，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)(2)同时涂一张同时涂一张上清液片上清液片做好标记，自然干做好标记，自然干燥；燥；(3)(3)余下的余下的沉淀物沉淀物进行下一步骤。进行下一步骤。7 7、用、用6ml 6ml 蔗糖一蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀物，溶液悬浮沉淀物，以以2500rpm2500rpm离心离心1515分钟弃上清，将残留液体分钟弃上清，将残留液体用吸管吹
10、打成悬液，滴一滴于干净的载玻片用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，上，涂片涂片，自然干燥。，自然干燥。8 8、将、涂片用、将、涂片用l l甲苯胺兰（或亚甲苯胺兰（或亚甲基蓝）甲基蓝）染色后盖片即可观察。染色后盖片即可观察。（二）高速离心分离提取线粒体（二）高速离心分离提取线粒体 1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以烧杯中取出，配平后，以17000g离心离心20分钟，分钟，弃上清，留取沉淀物。弃上清，留取沉淀物。（本实验用（本实验用12000rpm,非冷冻离心）非冷冻离心）2、加入蔗糖、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，
11、用吸管吹打成悬液，用吸管吹打成悬液，以以17000g离心离心20分钟分钟，将上清吸入另一试管中，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入留取沉淀物，加入0.1ml蔗糖蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶氯化钙溶液混匀成悬液液混匀成悬液(可用牙签可用牙签)。3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上干净载玻片上(分别分别标记标记、涂片涂片)，各滴，各滴一滴一滴1詹纳斯绿詹纳斯绿b染液染染液染20分钟分钟,盖片观盖片观察。察。4、油镜观察。、油镜观察。注意事项 1、各步骤加入的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。3、本实验所有操作本应在低温下进行，但实验室的冷冻离心机损坏，用普通离心机离心，温度和转速都和实验步骤有差别。实验报告 方法：按照实际的操作记录 结果：描述5张涂片镜下情况 讨论：1、实际情况和理论预期是否符合？为什么？2、本实验步骤有哪些可以改进的地方？
