1、斑马鱼肠道显微和超微结构的研究林金杏1，章琳俐2，姚一琳2，高诚1，胡建华1，陈秋生2(1 上海实验动物研究中心，上海201203;2 南京农业大学动物医学院，江苏 南京210095)摘要:应用光镜和电镜对斑马鱼肠道的组织形态和超微结构观察分析。斑马鱼肠道可分为前、中、后 3 段，肠壁由内向外分为黏膜层、肌层和浆膜层。测量肠道各段的绒毛高度、绒毛纵截面积、柱状上皮高度和肌层厚度，各指标从前肠到中肠和后肠呈逐渐降低趋势，前肠显著高于中肠和后肠(P0.05)，中肠和后肠间无显著差异(P0.05)。黏膜层向肠腔内折叠形成肠绒毛(多呈分枝状、指状)，分为黏膜上皮和固有层，柱状上皮细胞之间的连接复合体发
2、达，上皮细胞间分布着杯状细胞，上皮内淋巴细胞广泛分布于肠上皮下部，而肥大细胞主要分布在后肠上皮基底膜附近。细胞水平结果表明:斑马鱼肠道执行消化吸收的主要场所在前肠，肠道黏膜免疫机能与免疫细胞位置的分布相关。关键词:斑马鱼;肠道;显微结构;超微结构中图分类号:S852.1文献标志码:A文章编号:0529-5130(2013)03-0060-07斑马鱼(Danio rerio)属于鲤科短担尼鱼属，是国际标准化组织认可的实验用鱼类。1994 年在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议以及 Nature、Sci-ence等杂志发表专题评述，标志着斑马鱼已成为继小鼠、果蝇、线虫后又一生物学研究的重要模式生物12
3、。2009 年斑马鱼全基因组测序完成使其进一步成为公认的新型模式生物。作为美国冷泉港实验室的唯一海外分会场，冷泉港亚洲 2012 年会在苏州举行，以“以鱼求解:人类发育与疾病的斑马鱼模型”为主题，主要研讨了斑马鱼作为模式生物在癌症遗传学及治疗，造血模型、先天免疫和疾病等领域的研究。目前，国内外以斑马鱼为模式生物的研究正逐渐拓展和深入，斑马鱼被广泛应用于遗传学3、发育生物学45、神经 生 物 学6、免 疫 学7、人 类 疾 病 模型8、药物筛选9、毒理与环境检测等1011 方面的研究。鱼类和哺乳动物生活在非常不同的环境，因此很可能造成他们的肠道差异，包括解剖结构和肠道菌群12。目前，对于斑马鱼心
4、血管和免疫系统的研究颇为深入，而消化系统方面，主要以胚胎发育1314 和细胞信号传导调控1516 为对象的研究较多。了解肠道的形态结构特点对于鱼类营养、免疫应答和疾病防治都有重要意义，但斑马鱼肠道的形态学认识还有待研究。本文通过光镜及电镜观察斑马鱼肠道组织构造，为进一步营养学、免疫学、疾病模型和发育生物学等领域的研究提供形态学基础。收稿日期:2012-06-16;修回日期:2013-01-09基金项目:上海市科委资助项目(10140901100)。作者简介:林金杏(1983-)，女，博士，助理研究员，主要从事实 验 动 物 质 量 监 测 及 其 生 理 功 能 研 究，E-mail:。1材料
5、与方法1.1主要试剂苏木素、伊红、甲醛、酒精、二甲苯、中性树胶、戊二醛、饿酸、Epon812、醋酸铀、柠檬酸铅、巴比妥钠、-甘油磷酸钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钴、硫化铵等。1.2实验动物及样品采集AB 系斑马鱼饲养于上海实验动物研究中心ZEBTEC STANDALONE 独立水生动物养殖系统(意大利 TECHNIPLAST 公司)，温度 27 29，光照 L D=14 h 10 h，水体 pH 7.0 7.2，电导率 500 550 S。选用30 35 周龄成年斑马鱼13 尾，全长3540 mm，体长 27 30 mm，体重 0.3 0.6 g。斑马鱼在取材前 24 h 禁食以排空肠内容物。切除
6、斑马鱼头部和尾部，腹部经 10%中性福尔马林固定 24 h，取出内脏团，用 10%中性福尔马林再固定 24 h，用于形态学观察。1.3形态学观察斑马鱼内脏团二次固定 24 h 后，按常规石蜡包埋、连续切片(5 m)后苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后用 Olympus 显微镜观察并拍照。1.4数据采集选取 3 条斑马鱼的肠道做连续切片，每间隔 45m 取 1 片组织做成切片拍照，用 IPP 6.0 软件测量肠道肠绒毛高度、肠绒毛纵截面积、柱状上皮高度、肌层厚度和杯状细胞数目。肠道各段肠绒毛高度的测量:指从绒毛顶端到基部的垂直距离，在每张连续切片中各个肠段分别随机测量 2 3 个绒毛的高度
7、取其平均数作为该切片该肠段绒毛高度，再以所有连续切片各肠段绒毛高度的平均数作为此鱼的各肠段绒毛高06Animal Husbandry Veterinary Medicine2013Vol.45No.3度。肠绒毛纵截面积、上皮高度和肌层厚度的测量方法与绒毛高度相同。杯状细胞数目:每 100 m 长的黏膜层内杯状细胞的数目17。1.5酶细胞化学染色法取斑马鱼内脏团，在 PBS 中保持湿润，并立即做冰冻切片，切片厚度为 10 m，作钙-钴法显示碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPase)染色，O-lympus 显微镜观察并拍照。1.6透射电镜制样与观察将斑马鱼的肠道分为前、中
8、、后肠，并分别固定于 4 预冷的 2.5%戊二醛溶液中，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，丙酮置换，Epon812 包埋，经醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察并摄片。1.7统计分析数据采用 SPSS 软件进行方差分析，检验误差为5%水平，数据用“平均值标准差”表示。2结果2.1斑马鱼肠道分段斑马鱼无胃，食管很短，肠道紧随其后，起始端膨大，呈长管状，肠壁薄，肉眼观透明。斑马鱼肠道整体位于腹腔底部，头部被覆肝脏，呈“S”型排布，可分为 3 段:起始于膨大部，向后至第 1 折转处为前肠，折转向头部前行至膨大部左侧第 2 折转处的肠段为中肠，经第 2 折转沿中肠背侧后行的肠段为后肠。2.2斑马鱼肠道组织
9、学形态2.2.1前肠前肠管壁较厚，肠管较粗。起始膨大部内肠绒毛十分发达，呈交错分支状，之后渐变为指状，高度有所降低。单层柱状上皮细胞排列紧密，在比较发达的肠绒毛表面成簇排列，使得肠绒毛表面呈分叶状。前肠的杯状细胞数目众多，细胞头部大且圆，多成行排列于肠绒毛上皮细胞之间(图 1)，起始部肌层较厚，随着肠段的延伸逐渐变薄。2.2.2中肠与前肠相比，中肠管壁变薄，肠腔变窄，绒毛高度降低，截面积减小，多数表现为指状、锥状、齿状，局部肠绒毛消失为平坦的肠壁(图 2)。据测量统计，肠绒毛纵截面积、肠绒毛高度、柱状上皮的高度和肌层厚度与前肠相比均下降，差异显著(P0.05)。杯状细胞散在分布于黏膜表面，与前
10、肠相比数目略有升高，但差异不显著(P0.05)。结果见表 1。16畜牧与兽医2013 年第 45 卷第 3 期2.2.3后肠由表 1 可见，与中肠相比，后肠的肠绒毛高度略有增高，截面积略有增大，肌层略有增厚，但差异不显著(P0.05)。与前肠相比，后肠的肠绒毛纵截面积、肠绒毛高度、柱状上皮高度及肌层厚度均减少且差异显著(P0.05)。后肠的杯状细胞体积稍有缩小，多数表现为 2 3 行排列于黏膜表面，局部聚集成团(图 3)，平均每 100 m 长的黏膜表面有 8.932.92 个，与前肠和中肠相比差异均不显著(P 0.05)。表 1斑马鱼各段显微测量数据测量项目前肠中肠后肠肠绒毛纵截面积/m21
11、2 384.001 923.95a6 839.59853.02b7 018.861 148.40b肠绒毛高度/m157.7212.62a79.2412.49b82.6916.25b柱状上皮高度/m38.393.53a33.711.95b33.623.99b肌层厚度/m11.291.31a8.670.84b9.501.69b杯状细胞个数/100 m8.262.38a8.942.82a8.932.92a注:同行数据肩标字母不同表示差异显著(P0.05)，字母相同表示差异不显著(P0.05)。图 3斑马鱼后肠显微结构(HE 染色，标尺=50 m)。2.2.4肠壁由内向外，肠壁分为黏膜、肌和浆膜 3
12、层。黏膜由黏膜上皮和固有层组成，可见清晰的基底膜，无黏膜肌层和黏膜下层，无肠腺。单层柱状上皮衬附于黏膜表面，呈高柱状，排列整齐，胞核椭圆形，位于中部或偏于基底部。柱状上皮细胞之间分布有数量众多的杯状细胞，多为散在分布，也有成堆分布。杯状细胞头部膨大，充满黏液，开口于肠腔。上皮细胞之间常见淋巴细胞分布，多数位于基底部之间，少数见于游离端之间。固有层由结缔组织组成，较薄，未见肠腺。肠道的黏膜层向肠腔内折叠形成肠绒毛，多呈分枝状、指状。肌层分为 2 层平滑肌，内侧为环形肌，外侧为纵形肌。浆膜层很薄，由薄层结缔组织和单层扁平细胞组成。黏膜上皮游离面分布有纹状缘(图4)。ALPase 反应显示肠绒毛表面
13、纹状缘结构呈强阳性反应，表示纹状缘物质转运旺盛。图 4斑马鱼肠绒毛纹状缘(ALPase)2.3肠道的超微结构肠道黏膜上皮主要包括柱状上皮细胞、杯状细胞及少量淋巴细胞。固有膜主要为成纤维细胞和少量淋26Animal Husbandry Veterinary Medicine2013Vol.45No.3巴细胞，偶见肥大细胞存在基底膜附近。肠道前、中、后 3 段的细胞，形态上基本无明显差异，但分布上略有区别。2.3.1上皮细胞上皮细胞核位于胞体中央，偏于基底面，呈圆形或椭圆形，核仁明显，异染色质较多，主要分布在核基质和核内膜附近(图 5A);胞质内存在大量粗面内质网和次级溶酶体，主要存在于胞核和吞饮
14、小泡周围，在后肠发现次级溶酶体与吞饮小泡融合的形态(图 5B)。图 5电镜下斑马鱼肠道上皮细胞超微结构肠道黏膜上皮细胞以高柱状的柱状上皮细胞为主。柱状上皮细胞的核位于细胞中下部，呈长卵圆形;游离面密集排列着整齐的微绒毛，长约 0.70m，直径约 0.12 m。在各肠段的上皮细胞游离端均发现细胞之间的连接复合体，包括紧密连接、中间连接和桥粒，数量极为丰富，其中在中肠观察到众多桥粒组成串珠状形态(图 6A)。游离端细胞质内充满大量电子密度极高、脊明显的线粒体(图 6B)以及众多吞饮小泡(图 6C)，偶见有多泡体出现(图6D)。图 6电镜下斑马鱼肠道柱状上皮细胞超微结构36畜牧与兽医2013 年第
15、45 卷第 3 期2.3.2杯状细胞杯状细胞穿插于柱状上皮细胞游离端之间，数量众多，呈头部庞大，尾部细长的杯状。顶部膨大部充满大量泡状，电子密度不一的黏原颗粒，有膜包裹，开口于肠腔。细胞核及其他细胞器被挤在细长的尾部，胞质少且电子密度极高，细胞核、粗面内质网和次级溶酶体集中在中心部位(图 7)。图 7电镜下斑马鱼肠道杯状细胞超微结构2.3.3上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IELs)IELs 呈圆形或卵圆形，细胞核大，圆形或椭圆形，电子密度较高，异染色质粗大，在核中央和边缘均有分布，胞质少，在所有肠段内均广泛分布，主要出现在上皮细胞基底膜附近，游离端偶而
16、可见(图 5和 8)。图 8电镜下斑马鱼肠道肥大细胞、上皮内淋巴细胞超微结构2.3.4肥大细胞在中肠和后肠发现肥大细胞出现于上皮细胞基底膜附近，胞体较大且圆，细胞核椭圆形，位于细胞边缘，胞质中含有大量特征性的，高电子密度的大小不一的分泌颗粒，占据胞质大部分面积(图 8)。杯状细胞与肥大细胞在后肠的分布密度上多于前肠和中肠。3讨论哺乳动物和鸟类的肠道在形态结构上可根据特征性结构对肠道进行划分:十二指肠黏膜下层具有十二指肠腺，绒毛和微绒毛发达;回肠固有膜和黏膜下层分布着 Payer 氏结，绒毛逐渐减退;空肠介于十二指肠和回肠之间，长而弯曲18。但在鱼类，无十二指肠腺和 Payer 氏结等特征结构，肠各段的区别并不明显。关于鲤科鱼类肠道的分段问题争议较大，不同的学者各持己见，早先学者把鱼类肠管分为肠球和肠本部 2 部分19。Ng 等20 研究胚胎时期肠道形成时发现:在受精后 26 126 h，斑马鱼肠道的管腔形成并不断的生长，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮，从形态上可以分为 3 段(肠球、中肠和后肠)。本文根据斑马鱼肠道在鱼体内折行方向将其分为前、中、后 3 段。在鱼类，肠壁的组织学结构
