1、1新药石杉碱甲的发现 新药石杉碱甲的发现 俞超美（原浙江省医学科学院，杭州 310013）中草药有效成分石杉碱甲是中国药学工作者于 20 世纪 80 年代发现的一种具有全新化学结构的新一代高效、高选择性和可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂。它的首次发现源自于一种乡间俗名为蛇足草（又名千层塔）的石杉科蕨类植物，其学名鉴定为Lycopodium serratum Thunb.，后更名为Huperzia serrate(Thunb.)Trevis.1。石杉碱甲显著的药理作用和临床疗效2-4，现已在中国研发成用于治疗老年良性记忆障碍、改善由脑内胆碱能功能缺陷引起的阿尔茨海默氏症患者的记忆功能，以及缓解重症肌无力
2、等疾病的新药，并于 2005 年收载予中国药典5。石杉碱甲的发现不仅是中国中草药乃至世界植物药研究的重大成果和成功典范，而且也是中国在自主知识产权的新药发明史上的骄傲。本文记述了石杉碱甲的发现和研究的一些史实，同时也首次报告了有关的科学研究数据以及对石杉碱甲结构特征、互变异构体等的阐述。作为第一发明人6，作者亲历了石杉碱甲的发现以及其生产工艺的创建和完善的整个过程。1971 年，当时的浙江省卫生实验院（现浙江省医学科学院，以下简称浙江省医科院)药物研究所在开展浙江省民间中草药调查和整理过程中，发现药用植物蛇足草在浙南地区用于治疗跌打损伤，並具有退热、除湿、消瘀、止血等功能7。1972 年，浙江
3、省医科院药物所沈文照同志负责的浙江省蛇足草研究协作组开展了对蛇足草化学成分的研究，首次报道该植物的生物碱在动物实验上有横纹肌松弛作用。后又经临床试验证明，其有效的化学部位属非酚性强碱性生物碱8-9。1975 年，上海精神病防治院报道用该草药煎剂治疗精神分裂症有效。1979 年 4 月至 1980 年 2 月，浙江省蛇足草研究协作组用蛇足草中提取的强碱性总生物碱制成的“蛇足草号片”对精神分裂症进行了试治，但此课题因临床疗效不甚显著（治疗精神分裂症 114 例中，显著进步 10 例，有进步 29 例，无效者 75 例)10，最后伴随着当时的中草药运动的消声匿迹而终止。1981 年，作者在中科院上海
4、药物所作短期的访问和工作。该年 3 月，在沈文照同志的同意下並经当时浙江省医科院药物所领导的批准，作者被授权对植物蛇足草的生物碱成分开展进一步的研究。经初步研究，从 72 克蛇足草非酚性总碱中，首次分得 5 个结晶性生物碱，其中3 个被鉴定11。1982 年初，作者从上海药物所回来，重新审视了其对蛇足草活性化学成分的2初步研究，认识到该植物含有众多石杉生物碱的复杂性。鉴于常规用于生物碱薄层层析检出和柱层析分离的氧化铝吸附剂分离效果的不理想，首次设想和尝试对硅胶吸附剂进行碱化处理12。经过无数次制法条件的摸索和分离实验，获得了其对石杉生物碱类分离效果上的突破，这为后来的研究成果奠定了很重要的基础
5、。另外，作者决定改变研究方向，确立了将以往不曾重视的酚性生物碱类提取物作为进一步探索生物活性成分分离研究的新目标。新的研究开展后，在送往上海药物所药理室的几份从柱层析实验粗分得到的样品中，唐希灿同志发现它们在动物实验中显示了明显的抑制乙酰胆碱酯酶的活性。1982 年 3 月 17 日，从有活性的流分混合物中又进一步分离到了类白色的结晶单体。随后，该单体被进一步证明具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性(唐希灿.私人通信,1982.)，並择代号为“317”，后正式命名为石杉碱甲。石杉碱甲单体的发现和其展现的显著生物活性令人鼓舞。上海药物所唐希灿和朱元龙二同志主动前来洽谈，提出了他们希望参与石杉碱甲进一步
6、研究的要求，并签订了进行共同研究的协议。由于协议的签订和较好的研究前景，促使了当时浙江省医科院和药物所领导对该研究的极其重视，破例地为还是实习研究员的作者向当时的省科委补报了课题，并获得了一些特别经费的支持。此后，为开展下一步的化学、动物和临床试验等研究制备足够量的石杉碱甲材料，同时为建立并完善石杉碱甲的生产工艺，当时的伏纬华院长和周有作所长亲自带队和作者乘坐长途汽车，在山区的泥坑路上经受长达七、八个小时之久的颠簸，奔赴浙南地区商议草药蛇足草的大量收购亊项。在时任台州地区药检所所长李德英的热情协助下，与当地有关部门落实了对所需蛇足草的收购工作。这些前瞻性的策划为接下去的科研工作提供了后备保障。
7、从草药蛇足草中分离石杉碱甲单体是一个从大量到小量、从粗到精、繁杂和冗长的研制过程，它包括：药材的收购和粉碎；植物成分的乙醇提取和浓缩以获取总植物成分提取物；总植物成分提取物经酸液捏溶、氨水碱化、氯仿萃取，然后浓缩以获取总生物碱；总生物碱用强碱性溶液萃取、萃取液经酸碱度调节，然后用氯仿萃取以获得酚性生物碱和非酚性生物碱的分离；大型柱层析用的碱性硅胶的制备；酚性生物碱的制备性柱层析分离、流分接收、碱性硅胶薄层层析对目标流分检出和合并以获取石杉碱甲粗品；最后通过重结晶获取石杉碱甲的精品。在实验中，作者还观察到石杉碱甲在丙酮溶剂的结晶过程中形成二种晶体，它们呈现不同的红外吸收光谱。石杉碱甲在结构上不具
8、有酚羟基，它之所以能被用于酚性化合物提取的方法萃取是因为其结构 A 环的 2-吡啶酮在非极性溶液中能形成它的互变异构体 2-羟基吡啶，而后者就含具有弱酸性的酚性羟基。这种在溶剂中产生的互变异构现象在 1%NaOH 溶液中会失去平衡，直接驱使3这互变平衡中的 2-羟基吡啶完全转化成可以在碱性溶液中溶解的 2-羟基吡啶钠盐，见图 1。依此原理，石杉碱甲不光可以形成它的盐酸盐，也是可以形成它的钠盐以增加它的水溶度。图 1 石杉碱甲在碱性溶液中的互变异构现象 1983 年，一共收购了蛇足草 464.2 公斤，被分成 8 批次提取分离。其乙醇提取工序是借用了药材收购地的当地方药厂的设备分批完成的。其中，
9、6 批采用了乙醇热回流提取法，而最后 2 批采用了乙醇渗漉法。经比较，渗漉法获得的提取物含较少色素，但二法所致的石杉碱甲的得率无明显差异。从乙醇提取的总植物成分中萃取总生物碱的工作是在浙江省医科院药物所植化室进行的。由于生产批次多且量大，在蛇足草乙醇提取物经酸液捏溶、碱化后用氯仿萃取总生物碱的步骤中曾用到了容积大至 50 立升的蒸馏水瓶（具放水下口）作为分液漏斗，通过将其在实验台的铺垫上滾摇进行萃取。记得那时候实验室无特殊通风设置，由于提取期间对氯仿的长时间接触，竟能让人从实验人员的呼出气中嗅到浓浓的氯仿溶剂味，用毕的氯仿试剂瓶堆积似小山。总碱的萃取工作是在植化室同事韩燕艺、吴凤梧和戚宝凤等同
10、志的协助下一起完成的。随后的酚性生物碱的萃取以及石杉碱甲的制备性柱层析分离是与韩燕艺等同志一起经过数月的艰苦努力完成的。通过 7 批次的制备，累计获得石杉碱甲 48 克，平均得率为 9.8710-5，每克大约相当于生药量 9.7 公斤。根据作者设计的生产流程进行如此多批次的实践操练，这为 1983 年末的石杉碱甲生产工艺的形成、完善和起草提供了宝贵的第一手资料和可靠的科学依据，也为石杉碱甲的化学结构、药理作用、剂型、质量标准制定等的进一步研究，以及为后来的重症肌无力和老年性记忆减退患者的临床试治准备了药源。在石杉碱甲化学结构的初步鉴定中，作者发现其与文献中报道的石杉生物碱 Selagine13
11、在熔点、红外特征吸收及分子量诸分面极相似，但是二者旋光率达 51 度的显著差异。由于省医科院无条件作进一步结构分析，遂将石杉碱甲和与其同时分离获得的化合物石杉碱乙（Huperzine B）送交协作单位上海药物所，委托刘嘉森同志协助分析。核磁共振结构分析发现：石杉碱甲在环内双键烯碳 8 位上的质子由于受到邻位叔碳上的质子的隅合呈现双峰，而Selagine 的结构，其环内双键中含烯氢质子的烯碳是在 14 位，由于其邻位无质子偶合而应显示单峰。此外，二者的环外双键也呈现相反构形。正是因为二者结构具有如此显著的差异性，4这就在根本上彻底地否定了石杉碱甲为已知生物碱 Selagine 的可能性（图 2)
12、，从而确立了石杉碱甲化学结构的新异性以及它在天然产物化学文献和中草药中发掘新药的研究中的创新地位。图 2 石杉碱甲（Huperzine A）和 Selagine 的结构比较 石杉碱甲和石杉碱乙及其被制备的一些衍生物连同它们的药理作用在 1985 年申请，1993年获得美国专利（#5,177,082）6。该专利后来由于当时缺乏经验而导致过期，但是仍在美国专利局的资料库中记录在案並可查阅。1985 年 4 月 25 日，当时的浙江省卫生厅召开了鉴定会，对石杉碱甲的化学结构、药理作用、质量标准等进行了讨论并一致通过鉴定。1985 年底，被委托者刘嘉森则以第一和通讯作者的双重身份发表了关于石杉碱甲和石
13、杉碱乙的化学结构的论文14-15。1986 年 12 月 9 日浙江省医科院药物所和上海药物所对石杉碱甲及其注射液的研究获国家卫生部乙级科技奖。1987 年浙江省医科院药物所和上海药物所对石杉碱甲及其注射液的研究获浙江省科技成果二等奖（获奖人：俞超美，唐希灿，刘嘉森和韩燕艺）。之后，在申报国家科研成果时，浙江省医科院药物所和上海药物所所申请的“真性胆碱酯酶抑制剂新药-石杉碱甲”的课题，与中国军事科学院毒物药物研究所从石杉科马尾杉属的华南马尾杉中分离得到并命名为“福定碱”的相同化合物的类似研究课题相遇。1987 年 9 月，浙江省医科院药物所和上海药物所偕同中国军事医学科学院毒物药物研究所对石杉
14、碱甲的新药研究首次共获中国发明协会第三届全国发明金奖获奖人：俞超美(浙江省医科院药物所)，徐择邻(中国军事科学院)，唐希灿(中科院上海药物所)，刘嘉森(中科院上海药物所)，韩燕艺(浙江省医科院药物所)，赵庆余(中国军事科学院)，秦伯益(中国军事科学院)和周有作(浙江省医科院药物所)；参见中科院上海药物所科研成果网页 http:/ 1987 年 12 月浙江省医科院药物所和上海药物所又再次偕同中国军事医学科学院毒物药物研究所对石杉碱甲的新药研究共享国家科技发明二等奖（A02720）。这里值得一提的是，正如此前在接受中国发明协会颁发金奖时由各方认同的获奖人排列顺序之显示，它体现了我方当时不论在石杉
15、碱甲的新化学结构阐明和药理研究重要论文的正式发表方面，还是在临床研究、生产工艺和新药鉴定的通过等诸方面均领先于对方对福定碱研究的不争事实。国际上所有著名文献索引（如美国化学文摘，默克索引，等等）、权威杂志上发表的有关的化学和药理研究论文以及后来 2005 年版中国药典均接纳和肯定了我们为该具有显著乙酰胆碱酯酶抑5制作用的生物碱所冠的石杉碱甲（Huperzine A）之名。尽管如此，双方在获取国家发明奖前夕曾对各方发明人的名额和排列顺序进行了新的协商，最后我方以第一发明人让位给军科院人员的代价换取了多于对方二名发明人的署名权(刘嘉森.私人通讯 2015)。说也凑巧，之前文献报道生物碱 Selag
16、ine 的是作者的博士生导师 Wiesner 教授（已故加拿大著名天然产物化学家）和 Valenta 教授等人于 1960 年从当地的Lycopodium slago L.中发现，並通过一些化学降解的经典手段和初级的 60 兆周核磁共振仪的分析解决了它的化学结构。就在石杉碱甲的化学结构闻世 3 年之后，石杉碱甲和 Selagine 之间的结构之迷终于被加拿大 Alberta 大学 Ayer 教授（Wiesner 教授早期学生）的研究小组揭开了:他们在 Alberta省采集了得到过 Selagine 的同种植物並进行了重复研究。借助于现代光谱分析，他们发现从该植物中分离到的 Selagine 不仅与 Wiesner 教授实验室里过去 29 年前唯一幸存的、曾用于红外光谱分析的溴化钾压片中的 Selagine 样品（由二氯甲烷从中萃取而得）一致，而且也与石杉碱甲的结构吻合16。同时，他们也证明台湾学者报道的石杉生物碱 Isoselagine17也与石杉碱甲同属一物16。平心而论，凭着早年的实验条件，能如此推解出仅与石杉碱甲双键位置和构向不同的 Selagine 分子骨架已属不易。它们之间所
