1、发酵工程制药发酵工程制药 第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理生产原理 第二节：利用微生物进行药物的生产实例第二节：利用微生物进行药物的生产实例 一、发酵生产过程一、发酵生产过程 生产用菌种生产用菌种-原始材料原始材料-培养基培养基-程序程序-生产细则生产细则-以青霉素为例讲解以青霉素为例讲解（1）青霉素（）青霉素（penicillin）所用菌种所用菌种-黄青霉黄青霉菌菌 原始材料原始材料-氨基已氨基已二酸、半胱氨酸、缬二酸、半胱氨酸、缬氨酸。氨酸。发酵方法发酵方法-加前体加前体物质的深层发酵法。物质的深层发酵法。青霉素发现者弗莱明青霉素发现者弗
2、莱明 沙土管菌种沙土管菌种 转移到固体琼脂斜面培养基上，转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养培养5-6天，获得芽孢天，获得芽孢 芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养 进入移种瓶培养进入移种瓶培养 进种子罐，接种量为进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，进繁殖罐，28培养培养48-96小时小时 进入发酵罐，开始生产。进入发酵罐，开始生产。鼓式过滤鼓式过滤 第一次萃取器第一次萃取器 纯化柱纯化柱 第二次萃取器第二次萃取器 第三次萃取器第三次萃取器 真空结晶釜真空结晶釜 瓷过滤器瓷过滤器 结晶洗涤釜结晶洗涤釜 真空干燥器（结束）真空干燥器（结束）程序程序（1）使用消沫剂
3、，由于发酵过程中产生大量的）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。理。（2）温度控制在）温度控制在24-30、PH值控制在值控制在6.8-7.2。（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶值、氨、氮、溶解氧量。解氧量。（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无菌的。菌的。（5）发酵罐必须保持正压（）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净），以防罐外不洁净的
4、空气流入。的空气流入。（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位万多单位/ml，相当于相当于50g/L。生产细则生产细则 二、灭菌技术二、灭菌技术 灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。（一）灭菌项目（一）灭菌项目 （二）灭菌方法（二）灭菌方法 （三）灭菌的矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处 （四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术（一）灭菌项目（一）灭菌项目 1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。（二）灭菌方法（二）灭菌方法 2、化学法 1、加热法 3、辐射法 4、过滤法（三）灭菌的
5、矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处 对杀灭细菌的同时 1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。（四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术 可分为6种技术：1、间歇灭菌法、间歇灭菌法 2、加热灭菌法、加热灭菌法 3、连续灭菌法、连续灭菌法 4、空气加热灭菌法、空气加热灭菌法 5、空气过滤灭菌法、空气过滤灭菌法 6、营养物质瞬时高温杀菌法、营养物质瞬时高温杀菌法 1：间歇灭菌法：间歇灭菌法 又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。（1）灭菌方法）灭菌方法 （2）注意事项）注意事项 （3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点（1）灭菌方法
6、）灭菌方法 间歇灭菌的操作过程分为3个过程：加热-保温维持-冷却。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。（2）注意事项）注意事项 应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。（3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点 设备造价低廉。便于进行手动操作。2：加热灭菌法：加热灭菌法 隧道灭菌箱设备 3：连续灭菌法：连续灭菌法 （1）定义）定义 （2）技术分类）技术分类 （3）连续灭菌法的优点）连
7、续灭菌法的优点 （4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足（1）定义）定义 连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。（2）技术分类）技术分类 连续灭菌法可以分为2种：（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。（3）连续灭菌法的优点）连续灭菌法的优点 （1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。（3）容易实现自控操作。（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用
8、率。是目前很多制药厂经常采用的方法。（4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足 （1）投资较大，（2）需要同时设置加热、冷却装置。4：空气加热灭菌法：空气加热灭菌法 利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。不同温度下的空气细菌存活时间：200/15.1s，250/5.1s，300/2.1s，350/1.05s。干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。5：空气过滤灭菌法：空气过滤灭菌法 是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物
9、，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤）绝对过滤（2）深层过滤）深层过滤 陶瓷过滤机陶瓷过滤机（1）绝对过滤）绝对过滤 如超滤膜过滤就属于绝对过滤 是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗粒截留。（2）深层过滤）深层过滤 是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵
10、工业中广泛应用）。6：营养物质瞬时高温杀菌法：营养物质瞬时高温杀菌法 一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。三、分离纯化技术三、分离纯化技术 微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（二）初步分离，（三）
11、产品提纯，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。（四）产品的最终分离。（一）固体物质的去除（一）固体物质的去除 1、目的、目的 2、常用的方法有、常用的方法有 3、常用的设备、常用的设备 4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术 1、目的、目的 （1）分离出完整的细胞。（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。（3）除去细胞有残留碎片。（4）除去没有转化的不溶性基质。（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。2、常用的方法、常用的方法 （1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累
12、的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。3、常用的设备、常用的设备 （1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机 （2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备-管式离心沉降机。4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术 由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：（1）使细胞老化
13、凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。（二）初步分离（二）初步分离 进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发、蒸发 2、萃取、萃取 3、沉淀、沉淀 4、膜分离、膜分离 1、蒸发、蒸发 蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图系
14、列离心式刮板薄膜蒸发器示意图 蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。2、萃取、萃取 萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类 （1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取 （2）双水相萃取）双水相萃取（1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取 许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。SFT-150超
15、临界萃取反应仪超临界萃取反应仪 利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。（2）双水相萃取）双水相萃取 使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。3、沉淀、沉淀 蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋
16、白质不带电荷。蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。NSG-630浓缩分离机浓缩分离机 ZHN系列真空浓缩罐系列真空浓缩罐 沉淀和盐折的结合沉淀和盐折的结合 由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。4、膜分离、膜分离 膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。膜分离的优点（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小
