1、第四篇第四篇 第二章第二章 第二节第二节 溶血性贫血的实验室检测 什么叫溶血性贫血？什么叫溶血性贫血？各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血叫溶血性贫血。什么叫溶血性疾病？什么叫溶血性疾病？指骨髓代偿能力尚足以补偿红细胞的损耗而不出现贫血。溶血性贫血的分类 按溶血发生部位分类（按溶血发生部位分类（RBC破坏场所破坏场所）血管内溶血血管内溶血：RBC在血管内破坏在血管内破坏 DIC、机械性微血管病变、烧伤、输异型血、机械性微血管病变、烧伤、输异型血、PNH 血管外溶血血管外溶血：RBC在单核在单核-吞噬细胞系统吞噬或破坏吞噬细胞系统吞噬或破坏 AI
2、HA、遗传性球形细胞增多症、遗传性球形细胞增多症 溶血性贫血的分类 按病因及发病机制分类按病因及发病机制分类 RBC内在因素（遗传性内在因素（遗传性/获得性）获得性）RBC膜缺陷膜缺陷、RBC酶缺陷酶缺陷、珠蛋白异常珠蛋白异常（肽链肽链不平衡不平衡）RBC外在因素外在因素（获得性获得性）免疫性溶贫、机械损伤性、感染、物理因素、免疫性溶贫、机械损伤性、感染、物理因素、毒素、脾亢毒素、脾亢 溶血性贫血的诊断 确定是否有溶血确定是否有溶血（筛查检测）（筛查检测）红细胞破坏增加红细胞破坏增加 红系代偿性增生红系代偿性增生 哪一类溶贫哪一类溶贫（病因检测）（病因检测）一、溶血性贫血的筛查检测 珠蛋白珠蛋
3、白 血红素血红素 铁铁+卟啉卟啉 单核巨噬系统单核巨噬系统 脾脏脾脏 血管外溶血血管外溶血 RBC 血管内溶血血管内溶血 血浆游离血浆游离Hb 肾脏肾脏 血红蛋白尿血红蛋白尿 游离胆红素游离胆红素 肝脏肝脏 结合珠蛋白结合珠蛋白 近曲小管上皮细胞近曲小管上皮细胞 肾阈肾阈 结合胆红素结合胆红素 粪胆原的肠肝循环粪胆原的肠肝循环 含铁血黄素尿含铁血黄素尿 Rous 实验 胆汁胆汁 粪胆原粪胆原 肠道肠道 血液血液 肾脏肾脏 尿胆原尿胆原 高铁血红蛋白高铁血红蛋白 血红素血红素/清蛋白清蛋白 血管内、外溶血示意图血管内、外溶血示意图 1 2 3 4 5 6 7（一）红细胞破坏增加 RBCRBC寿命
4、测定寿命测定 51Cr同位素标记 参考值：2532天 半衰期15天，说明有溶血存在 1 参考值：0.5%，完全溶血，完全溶血0.38%；主要见于遗传性球形红细胞增多症，遗传性椭圆形细胞增多症、温抗体AIHA也可增高。脆性减低：脆性减低：主要见于海洋性贫血，也可见于缺铁性贫血、某些肝硬化等。1.红细胞渗透脆性试验【原理】原理】红细胞在孵育过程中，葡萄糖的消耗增加，而使贮备的ATP减少，导致需要能量的红细胞膜对阳离子的主动传递受阻，造成钠离子在红细胞内积聚钠离子在红细胞内积聚，细胞膨胀，孵育渗透脆性增加。【参考值】【参考值】未孵育 50%溶血4.04.45 g/L NaCl 37孵育24h 50%
5、溶血4.655.9 g/L NaCl【意义】【意义】脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 脆性减低 珠蛋白生成障碍性贫血 缺铁性贫血 脾切除术后 2.红细胞孵育渗透脆性试验 3.PNH相关检测 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNHPNH）：）：获得性红细胞膜缺陷的克隆性疾病红细胞膜缺陷的克隆性疾病，常在睡眠时加重，临床上可表现血管内溶血、栓塞、全血细胞减少等，有时可出现骨髓衰竭。PNH患者红细胞膜表面缺乏加速衰变因子（DAF，CD55）反应性溶血的膜抑制物（MIRL，CD59）等，使红细胞对补体敏感而溶血。1）蔗糖溶血试验）蔗糖溶血试验【原理】【原理】蔗糖离子浓度低，增强补体
6、与红细胞结合，使红细胞膜上形成小孔，蔗糖进入红细胞而致溶血。【参考值】【参考值】阴性【临床意义】【临床意义】PNH本试验常为阳性。可作为PNH筛选试验筛选试验，阴性可排除，阳性应作Ham 试验。3.PNH相关检测 2）蛇毒因子溶血试验【原理】【原理】蛇毒因子是种溶血因子，能直接激活补体C3，激活补体系统，造成溶血。【参考值】【参考值】溶血度5%【临床意义】【临床意义】特异性特异性PNH试验试验。3.PNH相关检测 3）酸溶血试验（Ham试验）【原理原理】膜蛋白缺陷的红细胞对补体敏感增加，在弱酸血清（pH6.66.8）中，经37 孵育后红细胞发生溶血。【参考值】参考值】阴性。【临床意义】临床意义
7、】酸溶血试验是诊断酸溶血试验是诊断PNHPNH的的主要确诊试主要确诊试验验。3.PNH相关检测 Ham试验 PNH患者不同时间尿样 4）CD55 CD59检测检测 【原理】【原理】CD55，CD59是补体调节蛋白，具有GPI锚定蛋白作用。PNH患者红细胞和粒细胞上GPI锚缺陷，无法结合在细胞膜上，导致对补体敏感，容易发生溶血。【参考范围】【参考范围】外周血中CD55，CD59阴性红细胞和中性粒细胞均10，主要确诊试验主要确诊试验 3.PNH相关检测 PNH诊断 1.初筛试验初筛试验 血管内溶血的特点血管内溶血的特点 血浆游离血红蛋白增高，结合珠蛋白血浆游离血红蛋白增高，结合珠蛋白(Hp)降低，
8、血红蛋白尿、尿中出现含铁血黄素、降低，血红蛋白尿、尿中出现含铁血黄素、蔗糖溶血试验等。蔗糖溶血试验等。2.诊断试验诊断试验 酸化血清溶血试验酸化血清溶血试验(Hams试验试验)、蛇毒因子、蛇毒因子溶血试验、溶血试验、CD55和和CD59检测。检测。（二）红细胞酶缺陷的检测 自身溶血试验及纠正试验 高铁血红蛋白还原试验 氰化物-抗坏血酸试验 变性珠蛋白小体生成试验 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性检测 丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定 1.自身溶血试验及纠正试验 【原理】【原理】细胞内酶缺陷（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6-PD、丙酮酸激酶），葡萄糖酵解障碍，不能提供足量ATP，红细胞在自
9、身血浆中温育48小时，不能继续从血浆摄取葡萄糖作能量来源，ATP减少，不能维持红细胞内钠泵作用，导致溶血增加。在温育过程中分别加入葡萄糖和ATP作纠正物，看溶血能否纠正。【参考值】【参考值】正常人轻微溶血，溶血度 3.5%；加葡萄糖、ATP溶血明显纠正，溶血度75%；高铁血红蛋白0.3-1.3g/L。【临床意义】【临床意义】G-6-PD缺陷，还原率显著降低。本试验是反映红细胞对高铁血红蛋白的还原能力，特异性较低，可用作G-6-PD缺乏的筛选试验筛选试验。【原理】【原理】抗坏血酸钠与HbO2反应生成H2O2，氰化钠能抑制过氧化氢酶使H2O2不受影响，从而使H2O2与GSH发生反应，产生氧化型谷光
10、氨肽，后者需要NADPH使其再还原为GSH。如红细胞内缺乏催化NAPDH形成的酶（G-6-PD），GSH产生减少，H2O2蓄积，HbO2被氧化成为棕色的高铁血红蛋白。【临床意义】【临床意义】正常血液几小时后才变为暗色；G-6-PD缺乏症患者血液呈棕色（阳性反应），纯合子2h，杂合子3-4h。可做为诊断G-6-PD缺乏症的一种过筛试过筛试验。验。3.氰化物氰化物-抗坏血酸试验抗坏血酸试验 4.变性珠蛋白小体生成试验变性珠蛋白小体生成试验 【原理】【原理】G-6-PD缺乏可致红细胞内的GSH含量减少，随之出现高铁血红蛋白增高，最后形成变性珠蛋白小体变性珠蛋白小体（Heinz bodies）。取G6
11、PD缺陷患者血液，加乙酰苯肼，37温育2-4h，推薄血片，1%煌焦油蓝染色，计算含5个或更多珠蛋白小体的红细胞百分率。【参考值】【参考值】30%【临床意义】【临床意义】G6PD缺陷症，不稳定缺陷症，不稳定Hb、HbH病等病等常高于常高于45%。5.葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（磷酸脱氢酶（G6PD）活性检测）活性检测 【原理】【原理】在G6PD和NADP存在下，G6PD能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。进一步可用紫外线分光光度测量法，对G-6-PD活性作定量测定。【参考值】【参考值】正常人有甚强荧光。【临床意义】【临床意义】G6PD缺陷者常延迟出现或不出现荧光点。可作
12、G-6-PD较特异的筛选试验较特异的筛选试验。6.丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定 【原理】【原理】在ADP存在下，PK催化烯醇式磷酸丙酮酸变为丙酮酸，在辅酶I还原型（NADH）存在下，丙酮酸被乳酸脱氢酶作用变为乳酸，若荧光标记于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD。进一步可用紫外分光光度测量法，对丙酮酸激酶活性作定量测定。【参考值】【参考值】正常PK活性荧光在20min内消失。【临床意义】【临床意义】丙酮酸激酶缺乏时，常延迟消失或达60min仍不消失，可作丙酮酸激酶较特异的筛选试验较特异的筛选试验。（三）珠蛋白生成异常的检测 血红蛋白电泳血红蛋白
13、电泳 胎儿血红蛋白酸洗脱试验 胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验 HbA2 定量测定 限制性内切酶谱分析【原理】【原理】利用各种血红蛋白的等电点不同的特点，在一定pH缓冲液中所带的正、负电荷不同，经电泳后各血红蛋白的移动方向和速度不同，既可将它们分开。【参考值参考值】琼脂胶电泳 血红蛋白A 95 血红蛋白A2 1.63.5 血红蛋白F 0.21.0 1.血红蛋白电泳【临床意义】【临床意义】该试验是为了确诊是否有异常血红蛋白异常血红蛋白存在，以及各种血红蛋白的比例。HbA2增高增高：诊断-轻型珠蛋白合成障碍性贫血轻型珠蛋白合成障碍性贫血最重要的诊断依据，此外个别恶性贫血、叶酸缺乏所致巨幼细胞贫血
14、、某些不稳定血红蛋白病也可增高。HbA2减低减低：缺铁性贫血、铁粒幼细胞贫血。1.血红蛋白电泳血红蛋白电泳 HbA2 HbF -珠蛋白合成障碍性贫珠蛋白合成障碍性贫血血 （地中海贫血）地中海贫血）1.血红蛋白电泳血红蛋白电泳 2.2.胎儿血红蛋白酸洗脱试验胎儿血红蛋白酸洗脱试验 【原理】【原理】HbF抗酸能力较HbA强。固定后的血片，置酸性缓冲液中保湿一定时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色而呈鲜红色。【临床意义】【临床意义】脐带血、新生儿、婴儿阳性，成人小于1%。地中海贫血患者地中海贫血患者轻型者仅少数红细胞呈阳性；重型者阳性红细胞明显增多。3.3.胎儿胎儿血红蛋白测定或血红蛋白
15、测定或HbFHbF碱变性试验碱变性试验 【原理】【原理】在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb可变性沉淀，测定其滤液中Hb含量，即HbF含量。【参考值】【参考值】成人2%新生儿55%-85%，1岁左右同成人 【临床意义】【临床意义】-珠蛋白合成障碍性贫血珠蛋白合成障碍性贫血患者明显增高，AL、AA、红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。4.4.HbA2 HbA2 定量测定定量测定 【参考值】【参考值】1.1%-3.2%。【临床意义】【临床意义】同血红蛋白电泳。5.5.限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析 是否存在珠蛋白基因突变、缺失等缺陷，Hb病的基因诊断。（四）自身免疫性溶血性贫血检测 体内免
16、疫发生异常，产生自身抗体或补体自身抗体或补体，结合在红细胞膜上，红细胞破坏加速而引起的一组溶血性贫血。抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验(Coombs test)冷凝集试验冷凝集试验 冷热双相溶血试验冷热双相溶血试验 1.抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验(Coombs test)【原理】【原理】红细胞的膜电位使两个红细胞间保持一定距离。不完全抗体不完全抗体IgG分子较小，无法连接两个邻近的红细胞而只能和一个红细胞抗原相结合。抗人球蛋白是完全抗体，可与多个红细胞表面不完全抗体的Fc段结合，使红细胞相互连接起来出现凝集现象，称为抗人球蛋白试验阳性。直接抗人球蛋白试验直接抗人球蛋白试验：红细胞红细胞表面有不完全抗体。间接抗人球蛋白试验间接抗人球蛋白试验：血清血清中有不完全抗体。将病人血清和正常将病人血清和正常RBC混合，再加入抗混合，再加入抗IgG试剂试剂 病人病人 血清血清 RBC 抗抗IgG【参考值】【参考值】正常人直接、间接抗人球蛋白试验均阴性【临床意义】【临床意义】1）阳性见于阳性见于AIHA，新生儿溶血病，SLE等 2）AIHA大多为温抗体型（37条件下作用最强，主要为IgG），少数为IgM
