1、基础研究117Research Articles中国分子心脏病学杂志 Volume 11 No.2 April 2011RAW264.7 细胞 M1/M2 亚型的诱导和鉴定陈涛 梁潇 贺明 乌宇亮 袁祖贻【摘要】目的 诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 分化为 M1/M2 亚型，并分别根据其标志物的表达情况进行鉴定。方法 干预前一天以 105个/ml 密度铺好细胞，用不同浓度的 IFN-+LPS 干预，刺激分化为 M1 亚型；用不同浓度 IL-4 干预，刺激分化为 M2 亚型。分别于干预后 12h 提取细胞的总 RNA。用 realtime PCR 方法对 M1/M2 亚型的标志物 iNOS,
2、CD86/MR（CD206），I 型精氨酸酶(ArginaseI，Arg-I)进行mRNA 水平表达量的鉴定，最终选择最合适的刺激浓度进行后续试验。结果(1).不同浓度干预试剂刺激 12h 后，大剂量干预组 RAW264.7的细胞状态差，死亡细胞数多，中小剂量组细胞状态良好，完全贴壁，但细胞的形态发生改变；(2).2.5ng/ml IFN-+200ng/ml LPS 共同作用 12h 后，RAW264.7 的 iNOS 和 CD86 表达量最高，较基础水平有明显差异；(3).10ng/ml IL-4 作用 12h 后，RAW264.7 的 MR(CD206)和ArgI 的表达量最高，较基础水平
3、有明显差异。结论 用适当浓度的 IFN-+LPS/IL-4 刺激 RAW264.7 细胞 12h，可使其分化为 M1/M2 亚型。【关键词】RAW264.7 细胞；M1/M2 亚型；炎症；动脉粥样硬化Introduction and Identifi cation of M1/M2 Phenotype of RAW264.7 Cells CHEN Tao1,LIANG Xiao1,YUAN Zuyi1,1Department of Cardiovascular Medicine,First Affi liated Hospital,Key Laboratory of Environment a
4、nd Gene Related Disease of Ministry Education,Xian Jiaotong University College of Medicine,Xian,710061,China.【Abstract】Objective To induce RAW264.7 cell line to M1/M2 phenotypes and identifi cate the cytokines expressed on the surface.Methods Plating the cells in 12 wells plate as 105/ml 24h before
5、intervention and use IFN-+LPS to induce M1 phenotype,IL-4 to induce M2 phenotype,with different concertration.Extracting total RNA of cells after intervention.Detecting the surface marker iNOS,CD86/MR,(CD206),ArginaseI(ArgI)of M1/M2 phenotypes,respectively,by realtime PCR on RNA level to select the
6、proper inducing concertration.Results(1).Cells retain well growth condition with inventional reagents of middle and smallest concertation but highest concertation;(2).iNOS and CD86 of RAW 264.7 cell increas-ing mostly after stimulated by 2.5ng/ml IFN-+LPS200ng/ml for 12h;(3).MR and Arg I of RAW 264.
7、7 cell increasing mostly after stimulated by 10ng/ml IL-4 for 12h.Conclusion RAW264.7 cell can be induced to M1/M2 phenotypes after stimulated by proper concertration of IFN-+LPS/IL-4,respectively.【Key words】RAW264.7 cell line;M1/M2 phenotypes;Infl ammation;Atherosclerosis(AS)动脉粥样硬化（AS）被认为是慢性炎症性疾病1，
8、巨噬细胞参与了病程中脂质沉积到斑块破裂的所有过程2。目前，对于巨噬细胞分型的研究成为该研究领域的热点，既往的研究认为在某些炎症性疾病中当巨噬细胞通过经典激活途径被诱导成为 M1 亚型后，可促进炎症的进展3，而通过替代激活途径被诱导成为 M2 亚型后，则具有抗炎的作用4。在炎症的推进过程中，由于受到不同的细胞信号通路和细胞因子的调控和影响，M1/M2 亚型的平衡一直处于动态变化中，向任何一方的倾斜都决定了炎症的最终转归。根据已有的文献5,6，使用 iNOS 和 CD86，鉴定 M1 型巨噬细胞，使用 MR 和 Arg I 鉴定 M2 型巨噬细胞是经典方法，但是对于刺激剂量仍无统一的标准，本研究旨
9、在摸索出较为合适的刺激浓度，在细胞状态良好的基础上成功诱导出 M1/M2 巨噬细胞亚型。在 AS 中，如能探明这一现象是否也符合上述研究的结论，则可以通过调控M1/M2 巨噬细胞比例，进一步影响 AS 的进展，为 AS 的治疗提供了新的分子生物学靶点。1 材料和方法 材料 小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 由第四军医大学肿瘤生基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81025002；No.30971219)；陕西省中医管理局资助项目沙棘提取物对 apoE 基因敲除小鼠动脉粥样硬化发生、发展的作用研究作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科；环境与疾病相关教育部重点实验室；陕西省分子
10、心脏病学重点实验室通讯作者：袁祖贻 Email:.基础研究118Research Articles中国分子心脏病学杂志 Volume 11 No.2 April 2011照组 Ct(目的基因 Ct-管家基因 Ct)-各组 Ct(目的基因-管家基因 Ct)。2.结果2.1 干预后 RAW264.7 的细胞形态改变：根据预定干预浓度对 RAW264.7 进行刺激 12h 后，电子显微镜下观察细胞的生长状态，发现 LPS，IFN-以及 IL-4 的大浓度干预组细胞死亡较多，存活的细胞状态亦较差，与正常培养条件下的细胞相比，细胞形态变小变圆，大多呈现出细胞皱缩，也没有正常的伪足伸出且贴壁能力较弱。而中
11、小剂量刺激组的细胞存活率高，细胞状态较正常培养情况下并无太多改变。（图）物学国家重点实验室保藏并惠赠；IFN-和 IL-4 购于美国Perprotech 公司；LPS 购于美国 Sigma 公司；小鼠 GAPDH，iNOS，CD86，MR 和 Arg 引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；SYBR Premix Ex TaqTM 购于宝生物工程（大连）有限公司；高糖 DMEM 培养基购于美国 In-vitrogen 公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RNA 提取试剂盒 Fastagen200 购于上海飞捷生物技术有限公司；RNA 逆转录试剂盒购于美国 Fermentas 公司；其余试剂
12、均为进口或国产分析纯试剂。方法 RAW264.7 细胞的培养和传代：含 10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基加入 80U/ml 氨苄青霉素和 100U/ml 链霉素后通过 0.22m 滤膜过滤除菌，于含 5%CO2 的 37恒温培养箱培养 RAW264.7 细胞，每隔 24h 至 48h 观察细胞状态并换液，必要时以 1:2 或 1:3 比例传代，以维持细胞的良好生长状态。M1/M2 亚型的刺激：干预前 12h 以 105个/ml 密度铺细胞于 12 孔板，以 1ml 完全培养基培养。待细胞完全贴壁且生长状态良好时加入不同浓度的刺激因子。根据不同文献的报道，将三种刺激因子的浓度均分为三个浓度梯
13、度，并进行分组。IFN-分为 25ng/ml，2.5ng/ml 和 1ng/ml 三个浓度梯度；LPS 分为 400ng/ml，200ng/ml 和 100ng/ml 三个浓度梯度；IL-4 分为 100ng/ml，10ng/ml 和 1ng/ml 三个浓度梯度。12h 后观察细胞状态并吸去培养基，冰 PBS 洗三遍，收集细胞。RNA 的提取和逆转录：将收集的细胞按照 RNA 提取试剂盒说明书操作，提取的总 RNA 使用两步法进行逆转录，第一步，12l 体系加入 1l random primer，65，5min；第二步，再 加 入 5buffer 4l，10nM dNTP 2l，inhibit
14、or enzyme1l和 reverse enzyme 1l，总体积为 20l，25，5min，45，60min，70,5min 进行反应。逆转录完毕收集 cDNA，直接进行 Realtime PCR 或储存于-20。Realtime PCR：采用 SYBR 嵌合荧光法，测量细胞各指标 mRNA 的表达（基因序列见表 1）。反应条件为 95温育l0s，95变性 5s，61.5退火 20 s，72延伸 12 s，共 45 个循环，每个反应做 3 个复孔。内参照采用 GAPDH。扩增完毕后进行溶解曲线分析，溶解曲线在产物 Tm 处表现为单峰，表明扩增特异性良好。因为目的基因与内参基因的扩增效率一致
15、，Realtime 定量 PCR 统计分析采用 2-Ct法，Ct=对表 1.realtime PCR 所用引物序列目的基因上游引物序列（5-3）下游引物序列（5-3）扩增长度Genebank IDiNOSCCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGCCCAAAGCCACGAGGCTCTGACAGCC497bpNM_010927.3CD86TCAGTCAGGATGGGAGTGGTAATCCAAGAGCCATTCCTACCT277bpNM_019388.3MRCATGAGGCTTCTCTTGCTTCTGTTGCCGTCTGAACTGAGATGG143bpNM_008625.2Arg ICAGA
16、AGAATGGAAGAGTCAGGGTGACTCCCTGCATATCTG250bpNM_007482.3GAPDHTCAACGGCACAGTCAAGGACTCCACGACATACTCAGC126bpNM_008084.2数据统计与分析：实验所得数据采用均数 标准差表示，组间采用方差分析及 t 检验，由 SPSS15.0 统计软件完成，P0.05 为差异有显著性意义。图 1 正常条件和不同条件干预 12h 后的 RAW264.7 细胞形态N 正常培养条件下的 RAW264.7 细胞A（M1-1）400ng/mlLPS+25ng/mlIFN-B（M1-2）200ng/mlLPS+25ng/mlIFN-C（M1-3）100ng/mlLPS+25ng/mlIFN-D（M1-4）400ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-E（M1-5）200ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-F（M1-6）100ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-G（M1-7）400ng/mlLPS+1ng/mlIFN-H（M1-8）200ng/mlLPS+1ng/mlIFN-I（M1-9）100ng/mlLP
