1、二次离心法制备富血小板血浆离心条件的比较金哲，吕刚，王禹祥（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）摘要目的探讨二次离心法制备富血小板血浆（PRP）的最佳离心条件和方法。方法从新西兰大白兔耳背中央动脉取血2.7 mL，按照不同离心条件（转速：1 0002000 r/min，时间：520 min）离心 2 次，比较不同条件下 PRP 中血小板浓度和血小板回收率。结果多种离心条件均能成功制备 PRP。初次离心：在形成白膜前的临界条件下（转速 1 400 r/min，10 min）取得上层血浆的操作简单，且血小板回收率最高（跃85%）。再次离心：转速 1 400 r/min、跃10 min
2、 时，即可制得符合要求的 PRP（浓缩率跃5倍）。结论初次离心条件和上清液的获取方法对 PRP 的回收率和浓缩率影响较大，在产生白膜前的临界条件下提取上清液操作简单，无需特殊设备，血小板浓度和回收率高，避免了离心速度过高或离心时间过长导致的血小板活化、聚集。该方法是制备 PRP 简便、有效的方法。关键词富血小板血浆；制备中图分类号R331文献标志码A文章编号0258-4646（2012）03-0237-03doi网络出版地址Effects of Different Platelet鄄rich Plasma Preparation Methods on the Concentration of
3、Platelet富血小板血浆（platelet鄄rich plasma，PRP）的制备方法主要有手工操作分离法与全自动血小板分离机分离法。在实验研究中多采用手工操作二次离心法，虽然其原理相似，但离心速度和时间差异很大，PRP 中血小板浓度也不尽相同，目前还缺乏公认的统一标准。本研究拟选择不同的离心条件制备PRP，旨在对制备 PRP 的离心方法进行优化。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物：健康新西兰大白兔 8 只（由中国医科大学实验动物中心提供），体质量 3耀3.5 kg。雌雄不限，自由进食水。随机分为初次离心组（=4）与再次离心组（=4）。1.1.2实验仪器：低速恒温离心机 KDC鄄20
4、46（科大创新股份有限公司中佳分公司）；全自动血细胞分析仪 XE2100（Sysmex 公司，日本）；真空采血管（蓝管，BD，美国）。1.2方法1.2.1采集抗凝血：实验前动物常规饲养 1 周，观察JIN Zhe，L譈 Gang，WANG Yu鄄xiang（Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）AbstractObjectiveTo explore an ideal method for PRP concentration by double cen
5、trifugation.MethodsTotally 2.7 milliliters wholeblood was collected from central ear artery of the albino rabbit，and centrifuged according to different conditions（Speed：1 000鄄2 000 r/min；time：5鄄20 min）.Calculating of the platelet concentration and recovery percent of platelet were performed.ResultsS
6、everal centrifuge con原ditions successfully prepared PRP.Initial centrifugation at 1 400 r/min for 10 min，which is the critical condition for the formation of Albug原inea，achieved highest rate of platelet recovery，and the operation of upper plasma is simple.Second centrifuge condition was set for 1 40
7、0 r/min10 min.Platelet counts in PRP prepared by four different methods were increased with respect to venous blood platelet counts.Percent re原covery of platelet by the second method was observed to be significantly higher when compared to other methods.ConclusionDouble cen原trifugation is an efficie
8、nt method for PRP preparation.Initial centrifugation conditions at speed of 1 400 r/min for 10 min and followed withanother centrifugation at 1 400 r/min（10 minutes）has the higher platelet count and percent recovery of platelet.It could be an efficientmethod for PRP preparation.Key wordsplatelet鄄ric
9、h plasma；preparation基金项目：辽宁省博士科研启动基金（20101137）作者简介：金哲（1973-），男，主治医师，博士.E-mail：收稿日期：2011-09-15网络出版时间：中国医科大学学报第 41 卷第 3 期2012 年 3 月Journal of China Medical UniversityVol.41No.3Mar.2012237窑窑PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 2012-03-28 08:18http:/ 200J1J2J31 400K1K2K31 600L11 800M12 000N1一般情况，术前 2 d 于 9 时由
10、耳缘静脉采血 0.5 mL，检测血常规，证实其为健康白兔。10豫水合氯醛腹腔注射麻醉（2 mL/kg）。用真空采血管在初次离心组兔耳背中央动脉采集 2.7 mL 抗凝血，混匀；另外采集0.5 mL 抗凝血，测定原始血小板浓度作为对照。1.2.2PRP 制备：按表 1 所示离心条件进行初次离心，无菌条件下注射器吸取上部的血浆得到离心液（A），如果形成白膜，则首先吸取白膜之上的血浆，再将针头贴壁靠近白膜，在管壁 0、4、8 点钟位置，慢速轻柔吸取，每点吸取约 0.05 mL，连同白膜之上的血浆转移到另一无菌离心管中，密封；取离心液（A）0.1 mL，加生理盐水 0.9 mL 稀释，测定血小板浓度，
11、计算血小板收集率。同样方法采集再次离心组的抗凝血，以初次离心确定的血小板收集率最高的离心条件初次离心，制备并收集离心液（A）到另一个无菌离心管中；按表 2 所示离心条件再次离心，轻柔地慢速由上至下吸取上部离心液（B）至另一离心管，底部剩余 0.5 mL 离心液（C）轻轻吹吸，使血细胞重悬于剩余的血浆中，即得 PRP。取 PRP 0.1 mL，加生理盐水 0.9 mL 稀释，测定血小板浓度，计算 PRP 中血小板浓度。2结果2.1初次离心初次离心条件为 A1、A2、A3、B1、B2、C1、C2 时，未形成白膜，红细胞沉降于离心管底部，B2、C1、C2时红细胞-血浆 A 界面基本形成，靠近界面的血
12、浆呈微红色；条件为 A4、B3鄄4、C3、D1鄄2、E1、F1 时，会形成白膜。离心液 A 的量随着转速与时间的增加而增加。在 C3、D2、E1、F1 条件下，血浆 A 的量基本一致，说明转速和时间达到一定程度时红细胞已经充分沉淀。初次离心条件为 C2（1 400 r/min伊10 min）时，血小板回收率最高（跃85%）（表 3）。初次离心后，如果不形成白膜，在手工吸取临近红细胞的上部血浆 A 时，界面常会出现不同程度的破坏；形成白膜时，采用定点、定量的方法吸取得到的血浆 A 的颜色不尽相同。2.2再次离心再次离心后，离心管底部可见薄层的白膜样物质，其下仍有少量的红细胞；离心液 B 呈现微黄
13、色，随着离心速度增高和/或离心时间延长，逐渐至清澈透明；轻轻吹吸底部剩余离心液 C，使沉淀的细胞成分解聚重悬，得到 PRP。PRP 呈乳白色至淡红色，未发现明显聚集成分。再次离心条件 K2、K3 时，即 1 400 r/min伊10min、1 400 r/min伊15 min 时，血小板浓缩率最高，达 5倍以上（表 4）。表 1初次离心条件Tab.1Initial centrifugation conditions表 2再次离心条件Tab.2Second centrifugation conditionsSpeedTime（min）（r/min）51015201 000A1A2A3A41 20
14、0B1B2B3B41 400C1C2C31 600D1D21 800E12 000F1表 3初次离心血小板回收率原始血小板浓度：（16326）109/LTab.3Platelet recovery of the initial centrifugation Originalplatelet concentration：（16326）109/L中国医科大学学报第 41 卷CentrifugationPlasma APlatelet concentrationRecoveryconditions（mL）（伊109/L）rate（%）A10.33575.2543.133 9A20.52386.254
15、5.637 4A30.73351.258.254A41.72157.561.554 2B10.35597.2547.497 7B20.67452.2568.849 7B30.83413.577.983 4B41.45253.583.520 8C10.4269065.848 7C20.87431.585.299 9C31.6212345.276 1D11.1152.2538.053 9D21.586422.976 6E11.527726.594F11.5573.2525.798 1238窑窑PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 CentrifugationPRPPlate
16、letConcentrationconditions（mL）concentration（伊109/L）ratio（%）J10.5202.5109.45J20.5611330.27J30.5665.5359.72K10.5548259.72K20.51042.5563.24K30.51100594.59L10.5550.5297.56M10.5568.5307.29N10.5594.75321.483讨论PRP 的制备方法主要有手工操作分离法与全自动血小板分离机分离法。虽然目前已有商品化的PRP 提取设备，但因价格昂贵，目前仍多采用手工操作分离法。但是在众多的研究中，由于离心速度和时间差异很大，最终制备的 PRP 的生物特性也不尽相同13，目前还缺乏公认的统一制备标准4。本研究结果显示，在一定的离心速度下，增加离心时间，离心液 A 的量增加，在 A4、B3、B4、C3、D1、D2、E1、F1 条件下，血小板会沉积在红细胞堆积层上形成白膜。Marx 等在制备 PRP 时发现，初次离心后白膜及其下 2 mm 红细胞堆积层中血小板浓度最高。而 Sonnleitner 等5初次离心（160）20
