1、黑龙江生物科技职业学院黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术生物制药技术 生物分离技术生物分离技术 主讲人：张爱华主讲人：张爱华 实训七、银耳多糖的制备及鉴定实训七、银耳多糖的制备及鉴定 实验原理实验原理 2 材料用具材料用具 3 操作方法操作方法 4 目的要求目的要求 2 1 5 5 注意事项注意事项 目的要求目的要求 了解银耳多糖制备的基本原理 掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术 原理原理 银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。不含核酸、蛋白质类物质。
2、可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用再用CTAB(CTAB(溴化十六烷基三甲铵溴化十六烷基三甲铵)络合法络合法 进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。材料用具材料用具 银耳子实体干品银耳子实体干品（50g50g左右）左右）烧杯烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。试剂试剂 （1 1）1 1复合酶制剂复
3、合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)；（2 2）2 2溴化十六烷基三甲铵（溴化十六烷基三甲铵（CTABCTAB）配制：）配制：取取2 g CTAB2 g CTAB溶于溶于100 mL100 mL蒸馏水中，摇匀备用；蒸馏水中，摇匀备用；（3 3）-萘酚配制：萘酚配制：-萘酚萘酚5g5g溶于溶于9595乙乙 （4 4）5%5%三氯乙酸三氯乙酸-正丁醇溶液；正丁醇溶液；（5 5）2mol2molL L的氢氧化钠溶液；的氢氧化钠溶液；（6 6）0.50.5甲苯胺乙醇溶液；甲苯胺乙醇溶液；（7 7）2mol2molL L氯化钠溶液；氯化钠溶液；
4、（8 8）2mol2molL L盐酸溶液；盐酸溶液；（9 9）活性炭；硅藻土。）活性炭；硅藻土。（1010）1 1融菌酶制剂；融菌酶制剂；（1111）无水乙醇；）无水乙醇；（1212）浓硫酸；）浓硫酸；（1313）乙醚。）乙醚。操作方法操作方法 1.银耳预处理银耳预处理 20 g 锈钢锅中锈钢锅中 加水加水 1600 mL 2025 浸泡浸泡30min 捣碎机捣碎机 中捣碎中捣碎 银耳银耳 浆液浆液 操作方法操作方法 2molL盐酸溶液调盐酸溶液调pH至至6.3 加加 入入 1 复复 合合 酶酶 制制 剂剂 50下下 酶促反应酶促反应 40min 银耳银耳 浆液浆液 2.酶浸提酶浸提 80灭酶
5、，灭酶，保温浸提保温浸提 约约1.5h 80 水浴水浴 浓缩浓缩 操作方法操作方法 等体积等体积5三氯乙酸三氯乙酸-正丁醇溶液正丁醇溶液 摇匀摇匀 离心离心（3000r/min）15 min 浓缩液浓缩液 3.多糖的沉淀（有机酸除杂）多糖的沉淀（有机酸除杂）下层下层 清液清液 备用备用 吸去上层吸去上层 正丁醇正丁醇 中层中层 变性变性 蛋白蛋白 操作方法操作方法 2molL的氢氧化钠溶液调的氢氧化钠溶液调pH至至7 摇匀摇匀 抽滤抽滤 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（脱色、透析脱色、透析）下层下层 清液清液 备用备用 加加1活活 性炭性炭80 加热加热 15 min 脱色脱色 滤液扎袋滤液扎袋
6、流水流水 透析透析12h 80水水 浴浓缩浴浓缩 抽滤抽滤 操作方法操作方法 加加3倍量倍量95乙醇乙醇 摇匀摇匀 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（乙醇沉析乙醇沉析）抽滤液抽滤液 离心离心（3000r/min）15min 沉淀沉淀 用无水用无水 乙醇洗乙醇洗 2次次 乙醚乙醚 洗涤洗涤 1次次 50 以下以下 真空真空 干燥干燥 操作方法操作方法 4.精制（一）精制（一）取粗取粗 品品1 g 溶于溶于100 mL水中水中 搅拌搅拌 静置静置 2h 2 CTAB 滤液滤液 离心离心 除不溶物除不溶物 60 解离解离 4 h 离心离心 3000r/min 15 min 80 热水热水 洗洗 氯氯 化化
7、 钠钠 2molL 溶溶 液液 100 mL 操作方法操作方法 4.精制（二）精制（二）解离液解离液 加加 三三 倍倍 量量 95 乙乙 醇醇 透析液透析液 8080 浓缩浓缩 离心离心 3000r/min 15 min 精品精品 银耳银耳 多糖多糖 离心离心 3000r/min 15 min 沉淀沉淀 用无水用无水 乙醇、乙醇、乙醚乙醚 洗涤洗涤 上清液上清液 流水流水 透析透析10h 50 真空真空 干燥干燥 操作方法操作方法 5.多糖的鉴定（一）多糖的鉴定（一）观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化 透析液透析液 1 mL -萘酚溶液萘酚溶液2滴滴 颜色变化颜色
8、变化 摇匀摇匀 沿管壁沿管壁 缓加缓加 入浓硫入浓硫 酸酸 1.5 mL(勿振动勿振动)操作方法操作方法 5.多糖的鉴定（二）多糖的鉴定（二）透析透析 浓缩浓缩 透析透析 浓缩浓缩 2 mL 点于滤纸点于滤纸 0.5甲苯胺乙醇溶液染色甲苯胺乙醇溶液染色 加入加入2CTAB溶液溶液24滴滴 观察现象观察现象 注意事项注意事项 1.1.酶促反应的时间、温度应控制好。酶促反应的时间、温度应控制好。2.2.在制备全流程中应时刻注意温度，在制备全流程中应时刻注意温度，不能超过不能超过8080 思考思考 题题 1加入复合酶制剂有何作用？加入复合酶制剂有何作用？2CTABCTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？3为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过8080？
