1、结核病细菌学检验的标准化结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展与新诊断技术进展 王甦民 2012年4月 强化结核病实验室诊断标准化的必要性 1、全球结核病控制的三大挑战：耐药结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民（流动人口）2、我国结核病疫情依然严重 3、目前结核病实验室诊断技术的不足 分类分类 结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。结核分枝杆菌特点结核分枝杆菌特点 结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10-20小时 细胞壁厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚
2、，含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。结核病细菌学检查的重要作用结核病细菌学检查的重要作用 细菌学检查是结核病最客观、最科学和最细菌学检查是结核病最客观、最科学和最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此重要诊断方法和流行病学研究工具。因此结核病的实验室检验仍然面临着较多的问结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。题。细菌学检验存在的问题 不易于标准化 操作误差较大（可达到30%）1、个人操作误差 2、标本性状 3、标本来源 对结果的理解差异可影响检验结果对临床治疗的参考或指导意义。主要的细菌学检验技术主要的细菌学检验技术 1 1、痰涂片抗酸染色、镜检技术、痰涂片抗酸染色
3、、镜检技术 2 2、分枝杆菌分离培养技术、分枝杆菌分离培养技术 3 3、分枝杆菌快速培养技术、分枝杆菌快速培养技术 4 4、药物敏感性实验技术、药物敏感性实验技术 5 5、分枝杆菌菌种鉴定技术、分枝杆菌菌种鉴定技术 标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术 标本的收集，特别是痰标本的采集、保存 制片和染色过程的标准化 读片操作的熟练程度和标准化 对结果的理解 痰标本的采集、保存和运送痰标本的采集、保存和运送 脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为3 3-5 5毫升。毫升。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注难以
4、获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。明标本性状，以供分析结果时参考。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。不能及时检验的痰标本应置不能及时检验的痰标本应置4C4C冰箱保存，冰箱保存，如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在专用的转运箱内运送。放在专用的转运箱内运送。标本的采集标本的采集 标本留取方法 痰标本的留取应在医护人员的指导下进行。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并说明唾液检出的可能性很小。检验
5、人员检查痰标本的性状，并在登记本和检验报告单上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分类登记）。如何正确留痰 查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法：1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。4、停止咳嗽后
6、，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。*注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。直接痰涂片检查法直接痰涂片检查法 萋尔-尼尔逊氏（ZiehlNeelsen）抗酸染色法（热染法）细菌学常规检查细菌学常规检查 直接涂片法直接涂片法 操作流程操作流程 涂涂 痰痰 膜膜 自自 然然 干干 燥燥 复复 红红 加加 热热 初初 染染 5 5 分分 钟钟
7、 自自 然然 干干 燥燥 镜镜 检检 流流 水水 冲冲 洗洗 美美 兰兰 复复 染染 3030 秒秒 盐盐 酸酸 酒酒 精精 脱脱 色色 流流 水水 冲冲 洗洗 流流 水水 冲冲 洗洗 载玻片载玻片（一一）新载玻片必须经新载玻片必须经9595%乙醇脱脂乙醇脱脂，检查无划痕后检查无划痕后 方可使用方可使用。（二二）一张载玻片只能涂抹一张载玻片只能涂抹1 1份痰标本份痰标本。（三三）载玻片只允许一次性使用载玻片只允许一次性使用，严禁清洗后重复用于严禁清洗后重复用于AFBAFB检查检查。（四四）载玻片正面一侧载玻片正面一侧1 1/3 3处标注实验室序号处标注实验室序号(如使用的如使用的载玻片一端无磨
8、砂面载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用可使用2 2B B铅笔在磨砂面上直接书写铅笔在磨砂面上直接书写)。（五五）载玻片正面另一侧载玻片正面另一侧2 2/3 3中央处均匀涂抹成面积为中央处均匀涂抹成面积为10102020 mmmm的卵圆形痰膜的卵圆形痰膜。染色染色（一一）严格按照操作规范完成染色程序严格按照操作规范完成染色程序。（二二）染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红无红色斑块色斑块。（三三）将染色后的玻片放置在报纸上将染色后的玻片放置在报纸上，如果如果透过痰膜不能分辨报纸
9、上的文字透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表则表明该玻片涂抹过厚明该玻片涂抹过厚，或染色过程有误或染色过程有误。（四四）染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的抹面积的1010%。（一一）为防止抗酸杆菌的交叉污染为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜严禁油镜头直接接触玻片上的痰膜头直接接触玻片上的痰膜。（二二）仔细观察仔细观察300300以上的视野以上的视野。（三三）每个工作日每个工作日，一名镜检人员的玻片阅读一名镜检人员的玻片阅读量一般不应超过量一般不应超过2525张张。（四四）连续阅读连续阅读10101212张玻片后张玻片后，应休息应休息2020分分钟左右钟左右。
10、镜检读片镜检读片 痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数检出菌数 每毫升标本估算菌数每毫升标本估算菌数 阳性结果机率阳性结果机率 0/100或更多视野或更多视野 1000 10 1-2/300视野视野 5000-10000 50 1-9/100视野视野 约约30000 80 1-9/10视野视野 约约50000 90（cv）1-9/每视野每视野 约约100000 96.2（cv）10或更多或更多/每视野每视野 约约500000 99.95（cv）查痰次数与阳性机率关系查痰次数与阳性机率关系 为什么诊断前强调三涂两培（为什么诊断前强调三涂两培（3S 2C）1 2
11、3 4 5 细菌学常规检查细菌学常规检查 直接涂片法直接涂片法 显微镜检报告方式：显微镜检报告方式：0 0条条/300/300视野：视野：萋萋-尼氏抗酸杆菌阴性尼氏抗酸杆菌阴性 1 1-8 8条条/300/300视野：实报菌数视野：实报菌数 3 3-9 9条条/100/100视野：萋视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（+）1 1-9 9条条/10/10视野：视野：萋萋-尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（2+2+）1 1-9 9条条/1/1视野：视野：萋萋-尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（3+3+）1010条条/1/1视野：视野：萋萋-尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（4+4+
12、）细菌学常规检查细菌学常规检查 直接涂片法直接涂片法 注意事项：注意事项：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂片阳选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂片阳性率较高；性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；交叉污染；打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。石炭酸复红初染时必须加温。细菌学常规检查细菌学常规检查 直接涂片法直接涂片法 优点：优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、是直接发现原菌的检查方法，适用于痰
13、、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。快速，数小时可报告结果。细菌学常规检查细菌学常规检查 直接涂片法直接涂片法 缺点：缺点：敏感性低：通常每毫升含敏感性低：通常每毫升含50005000-1000010000条以上抗酸条以上抗酸菌才可得到阳性结果；菌才可得到阳性结果；
14、特异性较低：只能报告特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性抗酸菌阳性”，不能区，不能区分结核和非结核分支杆菌；分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。涂片镜检质量保证系统涂片镜检质量保证系统 室内质控室内质控 标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。室的统一标准严格进行操作。复查方式：复查方式：自查：试验员当日对已
15、查涂片抽样复查。自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%10%涂片。涂片。涂片镜检质量保证系统涂片镜检质量保证系统室间质控室间质控 以现场和非现场督导为主要方式。以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实验室布局、安全防护、污染物处理、涂片染实验室布局、安全防护、污染物处理、涂片染色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复查。查。非现场督导
16、：防治人员依据盲法、按比例的原非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原则抽取涂片交实验室复查。则抽取涂片交实验室复查。复检玻片样本量复检玻片样本量 1 1.样本量估算：盲法复检的关键是复样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平际水平。世界卫生组织推荐世界卫生组织推荐8080%灵敏度灵敏度、100100%特异性特异性（针对阴性玻片针对阴性玻片）、误差为误差为0 0的可接受数量以及的可接受数量以及9595%可信限样本量表可信限样本量表，可以极大地减少样本量可以极大地减少样本量，保证了盲法复保证了盲法复检在统计学意义上可以代表被评估实验检在统计学意义上可以代表被评估实验室的总体水平室的总体水平。复检样本量计算表复检样本量计算表 上一年阴性上一年阴性 玻片的总数玻片的总数 玻片阳性率玻片阳性率 2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%300 185 129 101 80 67 59 50 400 217 143 108 86 70 61 51 500 243 154 114 89 71 62 52 700
