1、 DKSH细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征纳纳纳纳米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术(NTA)德国德国德国德国 ZetaView DKSHPage 2Intraluminal vesicles(ILVs)(Johnstone 1987)ExosomesMicrovesiclesEctosomes,Oncosomes,MicroparticlesThry et al.2009Van der Pool 2012Extracellular Vesicles(ISEV)Apoptotic bodies外泌体微泡外泌体和微泡其他的名称
2、凋亡小体统称细胞外囊泡 DKSHPage 3Lotvall,Hill et al,JEV(2014)以各种含膜纳米颗粒名称发表的文章数量 DKSHPage 4截止2017年6月在Pubmed上发表的Exosomes的文章数量统计 DKSHPage 5截止2017年6月在Pubmed上发表extracellular vesicles的文章数量统计 DKSHPage 65 m-15 m1 m-5 m100 nm 1 m30 100 nm细胞血小板细菌病毒凋亡小体微泡外泌体 DKSHPage 7细胞外囊泡分离的常规方法差速离心密度梯度离心体积排除色谱法超滤免疫捕获沉降 DKSHPage 8差速超速离
3、心被认为是外泌体纯化的金标准，但是得到的产率较低 DKSHPage 9细胞上清/尿液/唾液中外泌体分离的标准流程超速离心 DKSHPage 10血浆/血清中外泌体分离的标准流程超速离心 DKSHPage 11细胞上清，尿液和唾液中各种试剂盒分离外泌体的方法比较 DKSHPage 12血清和血浆中各种试剂盒分离外泌体的方法比较 DKSH细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法1#:Western Blotting2#:NTA(纳米颗粒追踪分析)3#:TEM(透射电镜)DKSH细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊
4、泡分析鉴定方法1#:Western Blotting2#:NTA(纳米颗粒追踪分析)3#:TEM(透射电镜)DKSHPage 15各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法 颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围DLSNTAFC粒径大小/nm颗粒浓度，每毫升颗粒数 DKSHPage 16细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向 标准化 分离纯化方法 不同类型微泡的命名 寻找疾病生物标记物 将细胞外囊泡用于疾病治疗 生产GMP级别的细胞外囊泡 不同来源细胞外囊泡的生物功
5、能研究 细胞外囊泡在细胞和组织中的染色成像 DKSH外泌体治疗外泌体治疗外泌体治疗外泌体治疗 用于包裹和运输药物的载体 自然生成 免疫惰性 保护内部包裹物 被目标细胞很容易接收 无内在毒性 包裹物多种多样:mi RNA,mRNA,蛋白质(抗体),药物,siRNA DKSHPage 18Raghu Kalluri教授教授教授教授将外泌体应用于癌症的早期诊断的想法是因为即使是癌症早期的患者，肿瘤也会在组织或血液中产生外泌体。由于这些外泌体来自于癌细胞，一旦将它们从血液或其它体液中分离出来，包含在其中关于癌细胞的信息能让我们了解到癌症是到了什么阶段了，是什么样的突变以及还能进一步分析其中蛋白、RNA
6、的信息，这样能够让我们精确地确定诊断和治疗方案。外泌体分子标记物和肿瘤诊断 DKSHPage 19国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和PMX老板老板老板老板Andrew Francis Hill 教授教授教授教授澳大利亚墨尔本拉筹伯大学分子科学学院生物化学与基因组学系主任。国际细胞囊泡大会(ISEV)现任主席。PMX公司老板：Margret Boeck（右一）Dr.Hanno Wachernig（左一）DKSHPage 202016.12.-2017.8参加过的学术会议和研讨会 DKSHPage 21可视化可视化可视化可视化进样进样进
7、样进样测量测量测量测量纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术 DKSHPage 22Zeta 电位颗粒数量粒径大小悬浮的纳米颗粒自动聚焦自动聚焦自动聚焦自动聚焦样品池横截面数字化相机物镜激光器ZetaView内部结构示意图内部结构示意图内部结构示意图内部结构示意图荧光配套的滤光片 DKSHPage 23参数参数参数参数相关物理性质相关物理性质相关物理性质相关物理性质举例举例举例举例粒径大小粒径范围和分布,颗粒团聚现象外泌体:30 170 nm微泡的存在颗粒浓度剂量,动力学变化治疗前后细胞外囊泡浓度的变化Zeta电位(表面电荷)代谢纳米金颗粒在表面处理前
8、后电荷的变化荧光生化鉴定抗体结合荧光标记 DKSHPage 24Applications of ZetaView?乳液?聚合物?荧光标记生物纳米颗粒?纳米金属颗粒?纳米气泡?量子点?不规则纳米颗粒?生物纳米颗粒?脂质体+胶束?药物运输?蛋白质团聚?病毒样颗粒(VLP)?病毒样品?细胞外囊泡(EV)DKSHPage 25布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小 Stokes-Einstein 方程 平均均方位移的时间间隔量化D=扩散系数=平均均方位移kB=Boltzmann常数T=温度=粘度r=颗粒半径纳米金颗粒 40 nmyx 检测颗粒的
9、位置 DKSHPage 26ZetaView对对对对50个和个和个和个和1000个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较Pos 2Pos 3Pos 4Pos 5Pos 6Pos 7Pos 8Pos 9Pos 11Pos 1002468100100200300400500Abs.number per binHydrodynamic diameter(NTA)/nm0501001502000100200300400500Abs.number per binHydrodynamic diameter(NTA)/nm05010015020001002003004
10、00500Abs.number per binHydrodynamic diameter(NTA)/nmPos 1 DKSHPage 27NTA 扫描扫描扫描扫描 自动多位点扫描自动多位点扫描自动多位点扫描自动多位点扫描 样品结果更有代表性样品结果更有代表性样品结果更有代表性样品结果更有代表性 每分钟每分钟每分钟每分钟 1000粒子粒子粒子粒子+异常值控制的有异常值控制的有异常值控制的有异常值控制的有效性分析效性分析效性分析效性分析激光器相机 DKSHPage 28重现性测试重现性测试重现性测试重现性测试每次测试拆卸样品池，自动对光聚焦偏差偏差偏差偏差 5%冲洗和自动对光冲洗和自动对光第一天第
11、二天第1次测试第2次测试第3次测试 DKSHPage 29通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度相机激光单位点测量体积单位点测量体积单位点测量体积单位点测量体积5 nL线性相关线性相关线性相关线性相关 DKSHPage 30100:150:120:110:1理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线 DKSHPage 31很一致10 R 500相机参数优化两个视频，两个SOPs100 nm和和和和500 nm颗粒人工混合颗粒人工混合颗粒人工混合颗粒人工混合 DKSHPage 32光学结构比较
12、光学结构比较光学结构比较光学结构比较10 x20 x放大倍数测量体积 1 nL 5 nL光学放大测量体积 DKSHPage 33卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征2.4 1013cm-36.2 1013cm-3n 500用水稀释200,000倍 DKSHPage 34果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒AuNP 30 nm in orange fruit juice低浓度低浓度低浓度低浓度（金属金属金属金属）纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测 DKSHPage 35什么是特异性检测什么是特异性检测什么是特异
13、性检测什么是特异性检测?DKSHPage 36exem荧光物质颗粒，微泡，脂质体等抗体EVs from HEK 293 cell line,AB with Alexa488荧光荧光荧光荧光 NTA (F-NTA)DKSHPage 37荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图表面带荧光表面带荧光表面带荧光表面带荧光探针的探针的探针的探针的40-1000nm的的的的颗粒颗粒颗粒颗粒40100200 nm DKSHPage 38聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样纯
14、粹的聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯颗粒数颗粒数颗粒数颗粒数1:1散射模式散射模式散射模式散射模式荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量 DKSHPage 39定量百分比定量百分比定量百分比定量百分比*荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记*DKSHPage 40荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式nF比率 nS/nF1:11,000:1100:110
15、,000:1散射模式散射模式散射模式散射模式nS动态比值超过动态比值超过动态比值超过动态比值超过可以超过可以超过可以超过可以超过10,000:110000个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒 DKSHPage 41散射模式散射模式散射模式散射模式荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式细胞外囊泡用细胞外囊泡用细胞外囊泡用细胞外囊泡用CMO染料染色染料染色染料染色染料染色(520|550)含膜颗粒含膜颗粒含膜颗粒含膜颗粒百分比百分比百分比百分比产率:85%*DKSHPage 42来自来自来
16、自来自HEK 293 细胞的囊泡细胞的囊泡细胞的囊泡细胞的囊泡，带带带带Alexa488的抗体的抗体的抗体的抗体带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记特异性结合的百分比1:1.10,000:1 DKSHPage 43带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点激发光激发光激发光激发光488 nm,激发的荧光激发的荧光激发的荧光激发的荧光605 nm DKSHPage 44染料染料染料染料光稳定性光稳定性光稳定性光稳定性Alexa Fluor+Atto+Fluoresbrite YG+Quantum dots(405 or 488)+Rhodamine B+DiO,DiL,CMO+PKH67+GFP+FITC-激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长激光波长激光波长激光波长滤光片滤光片滤光片滤光片405 nm430 LP488 nm500 LP520 nm550 LP660 nm680 LP对于对于对于对于小颗粒小颗粒小颗粒小颗粒
