1、实验诊断实习二实验诊断实习二 红细胞、网织红细胞检测红细胞、网织红细胞检测 目的和要求目的和要求 熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点 掌握血红蛋白测定方法、参考值和临床意义掌握血红蛋白测定方法、参考值和临床意义 掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意义床意义 红细胞计数红细胞计数(red blood cell count)红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内所含红细胞数目液内所含红细胞数目 原理：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，充入原理：用等渗稀
2、释液将全血稀释至一定倍数，充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量 方法：显微镜计数法方法：显微镜计数法 器材及试剂：器材及试剂：取血吸管，一次性定量采血管取血吸管，一次性定量采血管(20ul)计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为 9 个大方格个大方格面积为面积为 Imm 2。中央大方格用于红细胞计数，被双线等。中央大方格用于红细胞计数，被双线等分成分成 25 个中方格，每个中方格又划分为个中方格，每个中方格又划分为 1
3、6 个小方格个小方格。计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为 0.1mm 显微镜显微镜、盖玻片、刺血针、棉花等、盖玻片、刺血针、棉花等 小试管、刻度吸管小试管、刻度吸管、红细胞稀释液。、红细胞稀释液。其它其它:75%酒精棉球及干棉球酒精棉球及干棉球 操作操作:取血：取血：选择耳垂边缘或指端，先用75%酒精棉球消毒局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。待血液从针孔流出，用于棉花擦去第一滴血 轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。操作者用右手平拿取血吸管尖端浸入血滴中，缓缓吸血恰至“10”刻度处为止。然后用干棉花擦净吸管外沾附的血液
4、稀释及混匀稀释及混匀 先准备一清洁小试管，精确滴入红细胞稀释液 1.99 毫升，备用 将取好的血液立即挤入上述试管中，并来回吸取小量稀释液数次，以便将残余在吸管中的血液全部洗净 摇动试管，充分混匀。此时血液被稀释 200 倍 充池充池 先将计数板及盖玻片擦干净，并将盖玻片复盖于计数池上面。用吸管吸取己充分混匀的稀释血液一滴，滴于盖玻片的下方边缘处，稀释血液即充填入计数池中。注意勿发生气泡或使稀释血液流入计数池旁小槽内 静置 2 3 分钟，待红细胞完全下沉稳定后进行计数 计数 平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。观察红细胞
5、是否均匀，并调整至视野中间。方格。观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间。再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和右侧线上的细胞计入再将下侧和右侧线上的细胞计入。计数时必须按一定方向和。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。计数计数 5 个中方格个中方格(即四角的及中央的中方格即四角的及中央的中方格)由红细胞总共由红细胞总共的个数，将其结果乘以的个数，将其结果乘以 10
6、。即得每立方毫米血液中所含红细。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以胞数目，再乘以 10。即得每升血液中所含红细胞数目。即得每升血液中所含红细胞数目。每升血液中红细胞数目每升血液中红细胞数目=五个中方格内红细胞个数五个中方格内红细胞个数 5(变为变为 0.1u1)10(变为变为 1 u1)10 6(变为变为 1L)200(稀释倍数稀释倍数)=五个中方格内红细胞个数五个中方格内红细胞个数 10 10 清洁仪器：清洁仪器：计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干布擦干 吸管先用蒸馏水，继用吸管先用蒸馏水，继用 95%酒精，后用乙醚
7、洗涤干净，酒精，后用乙醚洗涤干净，保存备用保存备用 注意事项注意事项 不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血 所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水 操作迅速，充池一次完成，不能有气泡操作迅速，充池一次完成，不能有气泡 红细胞分布不均，每个中方格之间相差大于红细胞分布不均，每个中方格之间相差大于 20 个时要重个时要重新充池计数新充池计数 血红蛋白测定血红蛋白测定 方法：氰化高铁血红蛋白测定法 原理：血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾K3Fe(CN)6氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成
8、氰化高铁血红蛋白（HiCN）HiCN在540nm有一吸收峰 测定其光密度而得血红蛋白浓度浓度 试剂与器材 器材：分光光度计 试管，试管架 取血吸管:一次性定量采血管(20ul)刺血针 蒸馏水 75%酒精及干棉球 试剂：试剂：氰化高铁血红蛋白稀释剂 高铁氰化钾K3Fe(CN)6200mg 氰化钾（KCN）50mg 无水磷酸二氢钾140mg Triton X-100 1.0ml 用蒸馏水溶解并稀释 至1L 该试剂应呈透明、淡黄色，该试剂应呈透明、淡黄色，pHpH在在7.07.07.47.4之间，以蒸馏水之间，以蒸馏水作空白，在作空白，在540nm540nm比色，读数是比色，读数是0 0 溶液应放置
9、棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月冻结），至少可稳定数月 如发现试剂变绿、浑浊则不能使用如发现试剂变绿、浑浊则不能使用 其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改变引起的浑浊血浆蛋白改变引起的浑浊 实验步骤 在试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管 用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混匀 将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色 以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白
10、管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数 计算：计算：血红蛋白（血红蛋白（g/Lg/L）=测定管光密度测定管光密度（64458/4400064458/44000）251 251 =测定管光密度测定管光密度A 367.7367.7 式中：式中：（1 1）64458 64458 是目前国际公认的血红蛋白分子量是目前国际公认的血红蛋白分子量 （2 2）44000 44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度摩尔吸光度 （3 3）251251是稀释倍数是稀释倍数 方法评估方法评估 HiCNHiCN法操作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸法操
11、作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸光度直接计算结果被列为国际血红蛋白测定的参考方光度直接计算结果被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法法，也是我国推荐的首选方法 高球蛋白血症和白细胞明显增高可导致反应液浑浊而高球蛋白血症和白细胞明显增高可导致反应液浑浊而影响结果影响结果 注意事项注意事项 用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键 HiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN含量下降，测定结果偏低应贮存在棕色有塞玻璃瓶中 4冰箱保存一般可用数月，但不能在0以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使溶液褪色失
12、效 注意事项注意事项 分光光度计使用要点分光光度计使用要点 1、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置使用波长。仪器预热20分钟。2、打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。3调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。注意事项注意事项 氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序保管、操作 配制好的HiCN稀释液中因氰化
13、钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管 测定后的废液不能与酸性溶液混合氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体 为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中应注意废液处理，可用除毒液除毒 除毒方法 取硫酸亚铁（FeSO4 7H2O）二份加NaOH一份，在研钵中研细，配成100g/L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml，放置3小时，不时搅拌，使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾 废液加入等量的水，混合后每升加次氯酸铋液(安替福化)35 毫升，充分混匀后敞开容器，置室温 15 小时后，
14、排入下水道 参考值参考值多次检查多次检查 红细胞数 血红蛋白 成年男性（4.05.5）1012/L (400550万/mm3)120160g/L(1216g/dl)成年女性（3.55.0）1012/L (350500万/mm3)110150g/L (1115g/dl)新生儿（6.07.0）1012/L (600700万/mm3)170200g/L (1720g/dl)临床意义临床意义 红细胞及血红蛋白增多单位容积血液中红细胞及血红蛋白增多单位容积血液中 RBC 及血红及血红蛋白量高于参考高限蛋白量高于参考高限 可分为相对性增多和绝对性增多两大类可分为相对性增多和绝对性增多两大类 红细胞及血红蛋
15、白减少单位容积循环血液中红细胞及血红蛋白减少单位容积循环血液中 RBC、血红蛋白量及红细胞比积低于参考值低限，称为贫血。血红蛋白量及红细胞比积低于参考值低限，称为贫血。贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少 各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平行关系各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平行关系 RBC与与Hb小结小结 RBC Hb 增多 减少 相对增多 绝对增多 原发增多 继发增多 Epo代偿性增多 Epo非代偿性增多 缺氧 肿瘤 真性红细胞增多症 脱水 生理性减少 病理性减少 儿童，孕妇，老人 生成减少 破坏增加 丢失过多 各种溶血 各
16、种失血 造血干C障碍 DNA合成障碍 再障 巨贫 Hb合成障碍 多种机制 缺铁贫 白血病 造血原料缺乏 RBC与与Hb小结小结 红细胞（1012/L）血红蛋白（g/L）增多 正常 减少 增多 正常 减少 男性 6.0 4.0-5.5 4.0 170g 120-160g 120g 女性 5.5 3.5-5.0 3.5 160g 110-150g 110g 类型 MCV MCH MCHC 临床意义 大细胞性贫血 100 34 3236 巨幼细胞贫血 正细胞性贫血 80100 2734 3236 再障、骨髓病性 急性失血性贫血 小细胞性贫血 80 27 32 缺铁性贫血 铁粒幼细胞性贫血 海洋性贫血 单纯小细胞贫血 80 27 3236 慢性感染，肝病，尿毒症，恶性肿瘤，风湿病 网织红细胞计数网织红细胞计数 原理原理 网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞细胞 胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存,经经煌煌焦油蓝焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后或新亚甲蓝活体染色后,胞质中可见蓝或蓝绿色胞质中可
