1、植物蛋白质的提取和含量测定植物蛋白质的提取和含量测定 一、实验目的一、实验目的 掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白丙酮干粉的方法。丙酮干粉的方法。二、实验原理二、实验原理 1.1.大豆蛋白主要是酸性蛋白，大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5pI 4.5-5.05.0，能溶于碱溶液，能溶于碱溶液 本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低原理沉淀蛋白。2.Folin2.Folin-酚法测定蛋白质含量酚法测定蛋白质含量 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应，试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还原显蓝色
2、，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，可用比色法测定。三、实验器材三、实验器材 1.分光光度计（500nm），比色皿 2.计算纸（9 cm9 cm）3.离心机（离心管100ml、50ml）4.组织捣碎机 5.精密pH试纸pH 0.5-5.0;pH 4.5-7.0 四、实验试剂四、实验试剂 1.大豆干粉 2.0.2%NaOH 3.丙酮（预冷）4.6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml）6.Folin酚试剂甲（用前组分一:组分二=50:1）（1）1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。（2）0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解1
3、00毫升 1%酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O）中。每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。四、实验试剂四、实验试剂 7.Folin酚酚试剂乙试剂乙（用前稀释一倍）（用前稀释一倍）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1
4、升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。五、实验步骤五、实验步骤（一）蛋白提取（一）蛋白提取 1.1.称取称取3 3克大豆干粉，克大豆干粉，加入加入0.2%NaOH0.2%NaOH 3030毫升。（先加入调成糊状，再用毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min10min，于，于4000r/min4000r/min离心离心7min,7min,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，小心留取上清液，弃脂层和沉
5、淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；再经过滤；2.2.留出上清液留出上清液2 2毫升稀释毫升稀释5050倍做含量测定（第二步）倍做含量测定（第二步）3.3.制干粉：制干粉：量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L6mol/L的的HClHCl调调pHpH至至6.06.0，再用，再用1mol/L1mol/L的的HClHCl小心调小心调pHpH至至4.54.5-5.05.0，于，于4000r/min4000r/min离心离心15min15min，(留取沉淀物留取沉淀物)，并用少量丙酮反复，并用少量丙酮反复(至少两次至少两次)搅拌洗涤（在离心管中
6、进行），搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入4040度烘箱干燥，待整个实验结束度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率后，再称重并计算产率（即（即3 3克大豆干粉中蛋白含量）克大豆干粉中蛋白含量）。五、实验步骤五、实验步骤（二）蛋白含量测定（二）蛋白含量测定 1.1.制作标准曲线制作标准曲线 按照下表操作，以按照下表操作，以A500nmA500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲
7、。为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。2.2.测定提取第测定提取第2 2步稀释后样品的蛋白浓度步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据按上表中样品列操作，根据A500nmA500nm查找含量，并计算原始浓度。查找含量，并计算原始浓度。试管 试剂 ml 1 2 3 4 5 6 样 品 标准 BSA 蒸馏水 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.1(稀释 50 倍后)0.4 Folin酚试剂甲 各 4ml 4ml 混匀后静置 10min Folin酚试剂乙 各 0.5ml 0.5ml 混匀后静置 30min A500nm 0.000
