1、 郎朗郎朗 E-mail: 组织和细胞培养技术组织和细胞培养技术 参考书目：参考书目：组织和细胞培养技术主编：章静波组织和细胞培养技术主编：章静波 人肿瘤细胞培养主编人肿瘤细胞培养主编:R.R.弗雷纳弗雷纳 R.I.R.I.弗雷谢尼弗雷谢尼 细胞培养细胞培养主编：司徒镇强主编：司徒镇强 吴军正吴军正 第一章第一章 引引 论论 一、组织培养的诞生与发展简史一、组织培养的诞生与发展简史 18861886，His His 提出原始的胚胎神经元或成提出原始的胚胎神经元或成 神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，不神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，不 断延伸，直至其前端与周围感觉器官或肌肉断延伸，直至其
2、前端与周围感觉器官或肌肉 纤维接触为止。纤维接触为止。18901890，Cajal Cajal 应用胚胎神经组织切片的银应用胚胎神经组织切片的银 渍染色技术研究神经元的发生，结果支持了渍染色技术研究神经元的发生，结果支持了 HisHis的学说。的学说。反对反对HisHis和和CajalCajal的学者的学者 坚持坚持“细胞链细胞链”的理论，的理论，从成神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间从成神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间有许多分散的细胞，这些连贯的链细胞融合便形有许多分散的细胞，这些连贯的链细胞融合便形成了轴突。成了轴突。19071907，Harrison Harrison 悬滴培养
3、法，取蛙胚一片悬滴培养法，取蛙胚一片组织，采用成洼淋巴做培养基，能存活一周。组织，采用成洼淋巴做培养基，能存活一周。19101910，Burrows Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。脏组织及皮肤生长良好。BurrowsBurrows和和Carrel Carrel 成功培养了成年狗、猫、成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以至恶性组织的外植物。此外，证明小鼠、豚鼠以至恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液传代可延长细胞的寿命。同时，若把
4、胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。与血浆混合使用，存活的更好。CarrelCarrel（外科大夫）（外科大夫）发明卡式培养瓶发明卡式培养瓶 W.H.LewisW.H.Lewis和和M.R.Lewis M.R.Lewis 发展出许多合成培养基发展出许多合成培养基 19291929，Fell Fell 组织培养组织培养 我国始于我国始于2020世纪世纪3030年代年代 卵细胞的形成过程卵细胞的形成过程 2121三体综合征三体综合征先天愚型先天愚型 2121-三体综合症的病因为染色体数目异常，患者比正常人多一三体综合症的病因为染色体数目异常，患者比正常人多一条条2121号染色体。其多余的染色体号
5、染色体。其多余的染色体80%80%来自母亲，来自母亲，20%20%来自父亲。随着来自父亲。随着母亲年龄升高，发病的风险增大。母亲年龄升高，发病的风险增大。据估计我国目前大约有据估计我国目前大约有6060万以上的万以上的2121三体综合症患儿，按目前的三体综合症患儿，按目前的出生率我国平均出生率我国平均2020分钟就有一例分钟就有一例2121三体综合症患儿出生，全国每年三体综合症患儿出生，全国每年出生的唐氏综合症患儿将达出生的唐氏综合症患儿将达2700027000例左右。例左右。苏联遗传学家达拉森科和鲁夏诺娃对一些科学家的意见作了归纳：苏联遗传学家达拉森科和鲁夏诺娃对一些科学家的意见作了归纳：一
6、些人如斯特尔等认为，这是内分泌紊乱造成的，特别在一些年龄一些人如斯特尔等认为，这是内分泌紊乱造成的，特别在一些年龄偏大的妇女中；另一些人的假说认为，主发是药物、食物和饮水中偏大的妇女中；另一些人的假说认为，主发是药物、食物和饮水中的化学物质，引起了生殖细胞中染色体的异常。他们发现，在美国的化学物质，引起了生殖细胞中染色体的异常。他们发现，在美国中部中部2121三体综合症的发生率与水中氟的浓度有关。三体综合症的发生率与水中氟的浓度有关。头颅小而圆，枕部平，脸圆，鼻扁平，头颅小而圆，枕部平，脸圆，鼻扁平，睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，内眦睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，内眦赘皮明显，睫毛短而稀疏，常
7、有斜视。赘皮明显，睫毛短而稀疏，常有斜视。虹膜时有白斑，常有晶体混浊。嘴小唇虹膜时有白斑，常有晶体混浊。嘴小唇厚，舌大常外伸，耳小，低位耳，耳廓厚，舌大常外伸，耳小，低位耳，耳廓畸形。头发直而不卷曲。颈背部短而宽，畸形。头发直而不卷曲。颈背部短而宽，有过剩的皮肤。患者的平均寿命只有有过剩的皮肤。患者的平均寿命只有16.216.2岁。岁。5050的患儿在的患儿在5 5岁前即死亡。只岁前即死亡。只有有8 8的患者活过的患者活过4040岁，岁，2.62.6活过活过5050岁。岁。患者的寿命通常取决于有无严重的先天患者的寿命通常取决于有无严重的先天性心脏病和消化管畸形以及抗感染能力性心脏病和消化管畸形
8、以及抗感染能力的降低程度。的降低程度。二、组织培养常用术语二、组织培养常用术语 1.1.Cell culture(Cell culture(细胞培养细胞培养):):单个细胞在体外条单个细胞在体外条件下的生长。件下的生长。2.Cell line(2.Cell line(细胞系细胞系):):原代培养物经首次传代成原代培养物经首次传代成功后即成。功后即成。3.3.Cell strain(Cell strain(细胞株细胞株):):具有某些特征与标志的具有某些特征与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特征或标细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特征或标志在尔后的培养中必须保持下去。志在尔后的培养中必
9、须保持下去。4.4.Cell cycle(Cell cycle(细胞周期细胞周期):):细胞从前一次分裂结细胞从前一次分裂结束至本次分裂结束所经历的时相。束至本次分裂结束所经历的时相。5.5.Clone(Clone(克隆克隆):):单个细胞通过有丝分裂形成单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。的细胞群体，他们的遗传特性相同。6.6.Contact inhibition(Contact inhibition(接触抑制接触抑制):):体外培体外培养的贴壁细胞，相互接触时，便停止了分裂养的贴壁细胞，相互接触时，便停止了分裂增殖。增殖。7.7.Primary culture(Prim
10、ary culture(原代培养原代培养):):直接取自生直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。物体细胞、组织或器官开始的培养。8.8.Seeding efficiency(Seeding efficiency(贴壁率贴壁率):):在一定时在一定时间内，接种细胞贴附于培养皿表面的百分率。间内，接种细胞贴附于培养皿表面的百分率。9.9.SubSub-culture(culture(传代培养传代培养):):在体外培养条件在体外培养条件下，将细胞从一个培养皿移至另一个培养皿。下，将细胞从一个培养皿移至另一个培养皿。10.10.Suspension culture(Suspension cultu
11、re(悬浮培养悬浮培养):):细胞或细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。培养方式。11.11.Tissue culture(Tissue culture(组织培养组织培养):):组织在体外组织在体外条件下保存或生长。条件下保存或生长。1212.Apoptosis(Apoptosis(细胞凋亡细胞凋亡):):细胞内死亡程序的细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程，常称为程序性开启而导致细胞自杀的过程，常称为程序性细胞死亡。细胞死亡。第二章第二章 细胞培养的设备条件细胞培养的设备条件 一、细胞培养中常用的仪器设备一、细胞培养中常用的仪器设备
12、 1.1.无菌室：密闭性；通风透气良好；便于消无菌室：密闭性；通风透气良好；便于消 毒；方便进出毒；方便进出 2.2.超净工作台超净工作台:使无菌空气以微流使无菌空气以微流(0.32(0.32-0.480.48 米米/秒秒)方式，从工作台内流向工作台外。方式，从工作台内流向工作台外。3.3.纯水器：纯水器：18.2M18.2M,25,25 4.4.压力蒸气消毒器压力蒸气消毒器:玻璃器皿玻璃器皿(121(121,30min),30min),塑料（塑料（115115,15min),15min)5.5.电热恒温干燥箱电热恒温干燥箱:平衡培养的器材、试剂的平衡培养的器材、试剂的温度。温度。6.6.CO
13、CO2 2培养箱：培养箱：5%CO5%CO2 2,37,37,70%,70%酒精消毒内腔，酒精消毒内腔，加入无菌水，保证湿度，加入加入无菌水，保证湿度，加入CuSOCuSO4 4,预防霉菌。预防霉菌。7.7.恒温水浴锅：与细胞接触的液体要求保存与恒温水浴锅：与细胞接触的液体要求保存与于于4 4或或-2020，使用时，须预热。，使用时，须预热。8.8.液氮罐：常用液氮罐：常用3535和和5050立升两种，一般一周充立升两种，一般一周充一次，液氮温度达一次，液氮温度达-196196。9.9.倒置显微镜：观察细胞生长状态倒置显微镜：观察细胞生长状态 10.10.离心机：在分离、传代和处理培养的细胞时
14、，离心机：在分离、传代和处理培养的细胞时，常用离心的方法收集细胞。常用离心的方法收集细胞。11.11.无菌过滤器：无菌过滤器：ZeissZeiss滤器滤器(不锈钢不锈钢)，玻璃滤器，玻璃滤器及微孔滤膜滤器。及微孔滤膜滤器。12.12.洗刷装置洗刷装置 13.13.细胞计数板和电子细胞计数仪细胞计数板和电子细胞计数仪 CO2CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37 37，5 5COCO2 2 。使用使用CO2CO2培养箱培养细胞时应注培养箱培养细胞时应注意的问题：意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。
15、定保持培养箱内空气干净。定期消毒期消毒 箱内灭菌蒸馏水箱内灭菌蒸馏水30003000毫升蒸馏毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。养液蒸发。CO2CO2培养箱培养箱 干燥箱干燥箱 水浴锅水浴锅 滤器滤器 纯水仪纯水仪 液氮罐液氮罐 离心机离心机 酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器 二、细胞培养的无菌环境二、细胞培养的无菌环境 1.1.无菌室：相对的密闭、防尘、防菌无菌室：相对的密闭、防尘、防菌 1.1 1.1 无菌室的结构无菌室的结构 1.2 1.2 无菌室的消毒和防污染：每日使用前紫外线无菌室的消毒和防污染：每日使用前紫外线照射照射(1(1-2h),2
16、h),每周甲醛、乳酸或过氧乙酸熏蒸每周甲醛、乳酸或过氧乙酸熏蒸(2h),(2h),每月新洁儿灭擦拭地面和墙壁。每月新洁儿灭擦拭地面和墙壁。2.2.超净工作台超净工作台 2.1 2.1 原理原理 2.2 2.2 使用和保养：使用前开启紫外灯照射使用和保养：使用前开启紫外灯照射1010-30min30min。然后让超净工作台预工作。然后让超净工作台预工作1010-15min15min，以，以去除臭氧和使台面空间呈净化状态，使用完毕，去除臭氧和使台面空间呈净化状态，使用完毕，用用70%70%酒精擦拭干净。酒精擦拭干净。超净工作台的工作原理是利超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的微生物，滤器除去空气中的微生物，使空气得到净化，并使无菌使空气得到净化，并使无菌空气以微流（空气以微流（0.320.32-0.480.48米米/秒）方式，从工作台的工作秒）方式，从工作台的工作空间流向工作空间以外，保空间流向工作空间以外，保证工作空间的绝对证工作空间的绝对“无菌无菌”。超净工作台超净工作台 三、常用的培养器皿三、常用的培养器皿 1.1.玻璃器皿：玻璃器
