1、氧化应激与消化道功能的关系氧化应激与消化道功能的关系 汇报人：朱丽慧汇报人：朱丽慧 上海交通大学上海交通大学 20102010年年1010月月1717日日 主主 要要 内内 容容 1.1.氧化损伤的机理氧化损伤的机理 2.2.氧化应激与消化道损伤氧化应激与消化道损伤 3.3.抗氧化剂对氧化损伤的修复作用抗氧化剂对氧化损伤的修复作用 4.4.展望展望 氧化 应激 肠炎 肠蠕动紊乱 急性炎症 心血管疾病 代谢疾病 神经紊乱 一、氧化损伤的机理一、氧化损伤的机理 生物体在代谢过程中，产生许多自由基，这些自由基通常不会导致组织细胞的损伤，机体依靠自身体内的抗氧化防御体系，可以保护机体组织、细胞，防止自
2、由基的损伤。当生物机体细胞内产生的自由基的水平高于细胞的抗氧化防御能力时，氧化还原状态失衡，过量的自由基存在于组织或细胞内，即诱发氧化应激，并导致氧化损伤。氧化损伤氧化损伤 DNADNA氧化损伤氧化损伤 碱基损伤碱基损伤 DNADNA链的断裂链的断裂 蛋白质过氧化蛋白质过氧化 受体和酶受体和酶 细胞膜脂质过氧化细胞膜脂质过氧化 磷脂过氧化磷脂过氧化 NO 自由基自由基 辐射 高氧 高温 应应激激 脂质、蛋白质和DNA的氧化会对生物体造成不同程度的危害，从而影响机体的生长、发育、衰老等过程。急性和慢性的应激都能通过产生自由基诱导胃肠道的氧化应激。其中对消化道的氧化损伤在动物生产中发生率最高、隐蔽
3、性强、危害性大。过量的自由基极易诱发消化道疾病，给畜牧业的发展造成巨大损失。肠道的功能：消化和吸收营养物质 免疫 内分泌 粘膜屏障 肠道粘膜肠道粘膜是机体自身与外环境接触的最大界面,具有选择性渗透吸收营养物质和防御肠道内微生物及致炎因子入侵等屏障功能。肠粘膜屏障功能肠粘膜屏障功能 阻止肠腔内有害物质如致病微生物、抗原和促炎因子进入血液循环的作用，从而维护动物体健康。当此功能由于各种原因如感染、缺血、烧伤、急性胰腺炎等而损伤时，即可引起肠粘膜通透性增高，进一步引起肠道细菌移位和促炎因子大量释放，从而加重原发疾病，甚至诱发多脏器功能紊乱和衰竭的发生。肠粘膜屏障构成肠粘膜屏障构成 机械屏障 化学屏障
4、 生物屏障 免疫屏障 机械屏障机械屏障 机械屏障主要由紧密连接的粘膜上皮细胞以及鞘液凝胶层组成。化学屏障化学屏障 主要是胃酸、胆汁酸、粘液、溶菌酶、乳铁蛋白和各种消化酶等对阻止致病因子入侵，维护肠粘膜屏障具有重要作用。生物屏障生物屏障 在生理状态下机体的肠道存在大量共生细菌，它们通过分泌细菌毒素、产生短链脂肪酸、促进肠蠕动、占据致病菌粘附位点以及争夺营养素等多个环节防止有害细菌的侵入，维护动物体健康。而保持菌群间合适的数量与比例，对于维护肠粘膜屏障的完整性至关重要。免疫屏障免疫屏障 肠道相关淋巴组织包括肠集合淋巴小节，固有膜淋巴细胞和上皮内淋巴细胞，是机体内最大的免疫器官，在肠道执行局部免疫功
5、能，并与其它因素协同作用，维护肠粘膜屏障功能。二、氧化应激与消化道损伤二、氧化应激与消化道损伤 氧化应激产生自由基直接作用于细胞发挥作用。主要有四种致细胞损伤机制：主要有四种致细胞损伤机制：1）对脂类和细胞膜的破坏,从而导致细胞死亡。2）对蛋白质、酶的损伤,从而导致蛋白质变性,功能丧失和酶失活。3）对核酸和染色体的破坏,从而导致DNA链的断裂,染色体的畸变和断裂。4）对细胞外基质的破坏,从而使细胞外基质变得疏松,弹性降低。对消化道粘膜结构形态的损伤对消化道粘膜结构形态的损伤 肠粘膜中的细胞膜过脂质氧化，损伤肠粘膜组织，肠粘液层变薄、绒毛变短、绒毛表面积减少、隐窝变浅，过氧化物和自由基刺激肠道腺
6、体分泌，引起肠炎的发生，而腹泻又加剧了肠道粘膜组织的损伤程度。氧化应激对消化道功能的影响 对消化道屏障和吸收功能的影响对消化道屏障和吸收功能的影响 当肠道内氧自由基增加时，会使肠道中耐受能力较弱的乳酸菌数量减少，大肠杆菌的数量上升。营养素的吸收依赖于肠吸收细胞膜完整性，肠粘膜损伤，致使大量吸收细胞受到破坏，严重影响小肠吸收功能。对腺体的功能影响对腺体的功能影响 氧自由基的提高诱导生长抑素（somatostatin,SS）的分泌，SS具有广泛的内分泌抑制作用，抑制生长激素、生长调节素C以及多种胃肠道激素。仔猪断奶后，摄入的豆类蛋白种胰蛋白酶抑制因子会引起胰腺炎症，导致与消化功能紊乱。正常大鼠肠结
7、构正常大鼠肠结构 马可，马可，20062006 静脉注射静脉注射LPS后肠道病理变化后肠道病理变化 对照组 诱导组 修复组 对照组、LPS诱导组和复合抗氧化剂修复组空肠光镜照片(4)赵珂立，待发表赵珂立，待发表 胃溃疡胃溃疡 慢性胃炎慢性胃炎 消化性溃疡消化性溃疡 胃癌胃癌 结肠疾病结肠疾病 自由基与胃肠道疾病 氧自由基学说认为：幽门螺旋杆菌氧自由基学说认为：幽门螺旋杆菌(Hp)(Hp)致慢性胃致慢性胃炎的主要因素之一，而其诱发机制可能同氧自由炎的主要因素之一，而其诱发机制可能同氧自由基有关。基有关。与自由基有关，其中主要与与自由基有关，其中主要与NONO及及O O2 2-有关，氧自由有关，氧
8、自由基能直接作用于细胞的大分子，同时可作为细胞基能直接作用于细胞的大分子，同时可作为细胞内信息转导信号引起细胞浆内核转录因子内信息转导信号引起细胞浆内核转录因子(如如NFNF-kB)kB)激活，引起核内有关的基因转录增加。是很多激活，引起核内有关的基因转录增加。是很多急性、慢性炎症及免疫失调等疾病发生发展的分急性、慢性炎症及免疫失调等疾病发生发展的分子生物学基础。子生物学基础。人和动物研究中发现，病变肠黏膜中人和动物研究中发现，病变肠黏膜中ROSROS产产生明显增多，生明显增多，ROSROS同疾病活动性相关。同疾病活动性相关。在临床试验中发现给予自由基清除剂可以预防在临床试验中发现给予自由基清
9、除剂可以预防难治性溃疡复发，促进其愈合。难治性溃疡复发，促进其愈合。流行病学调查揭示，抗氧化剂如维生素流行病学调查揭示，抗氧化剂如维生素C C和维和维生素生素E E的缺乏与胃癌发生有关。补充维生素的缺乏与胃癌发生有关。补充维生素C C可可减少胃粘膜中的减少胃粘膜中的DNADNA损害。损害。氧化损伤的检测方法氧化损伤的检测方法 直接检测法直接检测法 电子自旋共振法电子自旋共振法 又称电子自旋共振(electron sp in resonance,ESR),是反应活性高、寿命短的自由基最直接最有效的测定方法。优点：灵敏度高,能检测到绝大多数的自由基。缺点：自旋波谱仪价格昂贵,操作复杂,在普通实验室
10、中难以推广。电子自旋共振波谱仪电子自旋共振波谱仪 化学发光法化学发光法 常用鲁米诺(luminol,5-胺基-邻苯二甲酰环肼)、光泽精等作为发光增效剂。其原理为,鲁米诺被ROS自由基氧化成激发态的氨基肽盐离子,当其返回基态时放出大量光子,从而对化学发光起放大作用。操作简单,价格低廉,目前被广泛用于ROS的检测和研究。间接间接 测定法测定法 脂质过氧化损伤的测定脂质过氧化损伤的测定 测定丙二醛的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度。常用硫代巴比妥酸法来测定丙二醛含量,此法是应用最多也是最古老的方法。DNADNA氧化损伤的检测氧化损伤的检测 DNA被氧化时,鸟苷酸的C-8是
11、最易发生损伤的位点。因而,由此形成的8-羟基脱氧鸟苷是评价DNA氧化损伤最常使用的生物标志物。8-羟基脱氧鸟苷的特异性单克隆抗体，彗星实验又称单细胞凝胶电泳。蛋白质氧化损伤的检测蛋白质氧化损伤的检测 其传统的检测技术是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶联免疫吸附法测定2,4-二硝基苯肼与蛋白质羰基反应生成的腙,来衡量蛋白质的损伤情况。抗氧化酶类的检测抗氧化酶类的检测 超氧化物歧化酶的检测SOD SOD能通过歧化作用清除氧自由基，测定SOD的活力可间接反应组织细胞抗氧化损伤、机体清除自由基的能力。直接法和间接法,包括电泳法、免疫法、ESR 法、化学发光法、脉冲辐解法、紫外分光光度计法等
12、。谷胱甘肽过氧化物酶的测定 是一种抗氧化酶,在氧化应激条件下,其在细胞的浓度明显减少。可采用紫外分光光度计法、分光光度法或者酶联免疫吸附法等进行测定。过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶是一种酶类清除剂，其机制实质上是过氧化氢的歧化,必须有两个过氢化氢先后与过氧化氢酶相遇且碰撞在活性中心上,才能发生反应。过氧化氢浓度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法对其进行检测。氧化应激导致细胞凋亡的检测方法氧化应激导致细胞凋亡的检测方法 氧化应激导致细胞凋亡的形态学检测 主要通过光镜伊红染色或吉姆萨染色和电镜对凋亡的细胞进行形态观察,可观察到染色质浓缩,核膜起皱破裂,凋亡小体形成等,以判别细胞凋亡。磷脂酰
13、丝氨酸外翻分析 ROS致细胞凋亡的早期改变之一是细胞膜磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转向细胞膜外。膜粘连蛋白5对转向到细胞膜外的细胞膜磷脂酰丝氨酸有高度的亲和性。用异硫氰酸荧光素标记膜粘连蛋白5,结合使用碘化丙啶对凋亡细胞进行双染色,即可区别凋亡细胞与坏死细胞。DNADNA片断化检测片断化检测 氧化应激致细胞凋亡时，其染色质发生浓缩,染色质DNA断裂,形成50300kb长的DNA大片段,或者180200bp 整数倍的寡核苷酸片段,健康活细胞DNA电泳为一条区带,而凋亡细胞DNA 电泳出现特征性的阶梯状条带。有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。陈群，2007 应激应激24h24h细胞细胞DNADN
14、A琼脂糖电泳图琼脂糖电泳图 氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测 Bcl-2基因的检测：Bcl-2的过度表达能阻抑多种凋亡相关基因的表达,如caspase23 的表达。测定方法主要有印迹杂交和实时荧光定量法。p53基因的检测；是细胞生长周期中负调节因子，氧化应激导致细胞DNA损伤的过程必须有p53参与。常采用免疫组织化学、原位杂交等方法来检测。核因子kB基因的检测（NF-kB）：在正常情况下是复合物，氧化应激状态下,NF-kB从复合体中解离并向核内移动,与位于核内的基因序列上特异性调控区结合,从而激活受调控的基因表达。免疫化学染色法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、原位杂交法
15、。三、抗氧化剂对氧化损伤的修复作用三、抗氧化剂对氧化损伤的修复作用 抗氧化物质主要的作用机制：抗氧化物质主要的作用机制：通过提供活性基团提供活性基团，作为供氢体与自由基反应作为供氢体与自由基反应，使之形成相应的离子或分子，灭活自由基，终止自由基的链式反应；提高抗氧化酶活性，降低膜的流动性，从而降低自由基反应，达到抑制脂质过氧化作用。酶类抗氧化剂 超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)过氧化氢酶(CAT)非酶类抗氧化剂 VE 硒 VC 新型天然抗氧化剂 茶多酚 类黄酮 中草药 微生物源性抗氧化剂 酶类抗氧化剂对各自由基的作用示意图 GSH-Px 韩雪，韩雪，2010 0246
16、81012实验第1-15日增重实验第15-45日增重实验第45-90日增重Weight Gain(g)游泳对照组微生物C维生素E茶多酚微生物复合不同抗氧化剂对应激小鼠增重的影响不同抗氧化剂对应激小鼠增重的影响 050100150200250300350400serum SOD activity(U/ml)安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组微生物组复合抗组不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中SOD活性的影响活性的影响 韩雪，韩雪，2010 0123456serum MDA concentration(nmol/ml)安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组TP组复合抗组不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中MDA含量的影响含量的影响 韩雪，韩雪，2010 010203040506070肝脏CAT(U/mgprot)CAT(U/mgprot)安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组微生物组复合组不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中CAT活性的影响活性的影响 韩雪，韩雪，2010 项目项目 对
