1、基因工程抗体的研究摘要：免疫学自诞生以来便一直是生物科学界的研究热点，其在医学临床等领域有着重要的应用，如免疫预防，免疫治疗和免疫诊断等。免疫学的研究对人类社会的发展做出了重要的贡献。近年来，随着基因工程技术的发展，免疫学的研究也取得了新的突破，对基因工程抗体，基因工程疫苗，基因工程细胞治疗等研究的深入，使免疫学研究进入了新的阶段。抗体分子作为免疫学研究的核心之一，在基因工程等技术的改造下，产生了新的价值。通过基因工程等技术，对抗体分子进行改造，优化了许多传统抗体分子应用的弊端，提高了抗体分子应用的水平和效率，具有广阔的发展前景。但有些新技术也存在问题，需要逐步完善优化才可广泛使用，本文对基因
2、工程技术在抗体分子研究领域的应用，存在的问题及发展前景等方面进行了综述。关键词：基因工程抗体，免疫学，人源化技术，抗体药物Study On Genetically Engineered AntibodyAbstract: Immunology has been a research hotspot in bioscience since its birth. It has an important application in the field of clinical medicine, such as immunoprophylaxis, immunotherapy and immunod
3、iagnosis. Immunology research has made an important contribution to the development of human society. In recent years, with the development of genetic engineering technology, immunology research has also made new breakthroughs. With the in-depth study of genetic engineering antibody, genetic enginee
4、ring vaccine, and genetic engineering cell therapy, immunology research has entered a new stage. As one of the core of immunology research, antibody molecules had new value under the transformation of gene engineering and other technologies. Through genetic engineering and other technologies, the an
5、tibody molecules were modified to optimize the disadvantages of many traditional antibody molecules, improve the level and efficiency of the application of antibody molecules, and have broad prospects for development. However, some new technologies also have some problems that need to be gradually i
6、mproved and optimized before they can be widely used. This article reviews the application of genetic engineering technology in the field of antibody molecule research, existing problems and development prospects.Keywords: Genetically engineered antibodies; Immunology; Humanized technology; Antibody
7、 drugs引言抗体(antibody)是免疫系统中重要的免疫分子，可以识别并特异性结合抗原，具有中和毒素，阻止病原体入侵，激活补体系统产生膜攻击复合体破坏靶细胞，调理吞噬细胞以及介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等重要免疫功能。自1975年，Kohler等1建立了B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)技术，利用该技术可获得大量特异性很高的抗体，使免疫学得到了很大的发展，该技术可广泛用于疾病的诊断与治疗等研究中。但是单克隆抗体本身的性质限制了它的临床应用，如：由于人-人单克隆抗体杂交瘤技术不成熟2，应用于临床的鼠源性单克隆抗体对人具有抗原性，
8、且会引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody reaction;HAMA reaction)3，此外产生的单克隆抗体分子量过大，难以通过血脑屏障，胎盘等结构。随着分子生物学的发展，基因工程技术取得重要突破，对免疫学的研究产生了重要的影响。80年代，科研人员通过DNA重组技术，对已有的单克隆抗体基因进行改造获得了人源化程度高，分子量小且特异性高的抗体，使抗体技术更好的为人类服务。现已通过基因工程技术构建出人源化抗体及全人抗体，使其抗原性显著降低，更有利于临床应用；在抗体类药物的研究方面也取得了巨大的突破，双特异性抗体，融合蛋白等改造抗体，因具有较高特异性及较强的亲和
9、力而被广泛研究及应用；此外，噬菌体展示技术及核糖体展示技术的开发并应用于蛋白质类药物的筛选，抗体作用的研究，医学诊断和治疗等领域也显示了良好的成效。1 基因工程抗体1.1 嵌合抗体(chimeric-antibody)嵌合抗体的基因是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的C 区基因拼接而成，将连接后的基因构建相应载体，转染骨髓瘤细胞，获得分泌人-鼠嵌合抗体的骨髓瘤细胞。该类抗体人源化程度达到70，是通过基因工程技术最早制备成功的抗体。1984年，Morrison等4-5在前人研究的基础上，创立了人-鼠嵌合抗体技术,通过该方式获得的人-鼠嵌合抗体保留了原鼠单克隆抗体的高特异性和亲和力，减少了鼠源成分
10、，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，且其人源Fc片段能有效介导ADCC等生物学效应，还具有操作相对方便，以及可根据不同需要选择性变换多种亚型等优点。目前，该类抗体已在抗肿瘤，治疗类风湿性关节炎，以及器官移植的抗排斥治疗中应用广泛，其中由美国FDA批准的主要应用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和类风湿性关节炎(RA)等疾病的Rituxan(rituximab)嵌合抗体比较典型，此外还有Erbitux(cetuximab),Simulect等嵌合抗体也较为常见6-7。但该类抗体鼠源性仍然高达30，仍会诱发HAMA反应，临床应用与研究仍然受限。1.2 改型抗体改型抗体
11、又叫CDR移植抗体(complementary determination region antibody), 是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（CDR）的氨基酸序列换成鼠源单抗CDR序列，该抗体的3个互补决定区(CDR)为鼠源性成分，而骨架区(FR)等为人源性成分，在嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源性成分，使该抗体的人源化程度达到90%以上，该类抗体被应用于癌症等疾病的治疗取得了较显著的成效。我国食品药品监督管理局(SFDA)在2008年批准上市的由我国百泰生物药业二次开发的CDR移植抗体-泰欣生（尼妥珠单抗注射液），人源化程度达到95%，该类抗体联合放疗、化疗等对治疗神
12、经胶质瘤，胰腺癌，食道癌，肝癌等实体瘤具有较高的临床价值8。但由于该类抗体仍未完全解决鼠源性成分的抗原性问题，CDR移植常导致抗体分子亲和力下降，且该操作不具有普遍性等缺点，限制了该类抗体的发展9。1.3 小分子抗体1.3.1 Fab及F(ab)2 片段 Fab 片段( fragment with antigen binding，Fab) 由完整轻链和重链的VH 与CH1构成，其大小仅为完整抗体的1/3，通过基因工程技术将轻链和重链可变区分别与人抗体的 链和重链CH1重组，获得重组Fab,该类抗体分子量小、亲和力高、抗原性低, 在生物治疗领域可用于导向药物显影和靶向生物治疗剂等。目前已有多个片
13、段药物获得FDA批准上市。如作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药的阿昔单抗( abciximab，ReoPro)；治疗黄斑变性的兰尼单抗( lucentis)以及治疗克罗恩病和风湿性关节炎的阿昔单抗（abciximab，ReoPro）等。F(ab)2是由两个Fab片段通过铰链区相连形成的小分子抗体在临床常用于放射免疫治疗，Cheng等10利用基因工程技术,将抗肿瘤的糖蛋白F(ab)2片段与放射性元素125I/131I连接构建了耦联蛋白CC49,该抗体具有较高亲和力，具有较强的定位肿瘤的能力。1.3.2 单链抗体单链抗体（single chain antibody fragment，sc
14、Fv），是利用基因工程技术，将抗体重链可变区和轻链可变区通过1520个氨基酸的短肽连接而成的抗体，是具有抗体活性的最小功能单位11。该类抗体的分子量仅为完整抗体的1/6，具有分子量小、穿透力强、抗原性弱等明显优势，scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，可分别在胞内，胞外表达也可以融合蛋白形式表达，且其在体内循环的半衰期短，易清除。单链抗体在生物医学中较广泛用于靶向治疗，利用重组技术将单链抗体(scFv)与白细胞介素-2(IL-2),蓖麻毒素，肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)等毒性蛋白或细胞因子融合,形成免疫毒素等特异性杀伤靶细胞。此外，该类抗体在生物检测、诊断方面也具有显著优势，它具
15、有分子量小，穿透力强，在组织中分布指数高的特点，且其携带的放射性核素在体内排出快，常用于肿瘤的显像定位诊断12。1.3.3 纳米抗体和分子识别单位1.3.3.1 纳米抗体纳米抗体又称为单域抗体（VHH），由一个重链可变区组成,其抗原结合区为与铰链区相连的Fc区单结构域,其分子量约为完整抗体的1/10。VHH具有良好的亲和力，且具有高度水溶性和稳定性，使其在胃液和内脏等器官中仍保持抗原结合活性，通过基因工程技术，对人源抗体VH结构域FR2中的一些氨基酸进行VHH特征性改造,可得到单域VH抗体。VHH抗体可结合一些常规抗体无法结合的抗原表位。并可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用
16、该特点设计酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等，由于该类抗体分子量很小可穿过血脑屏障等结构，在治疗神经性疾病和脑肿瘤等疾病方面具有广阔发展前景。纳米抗体也可制成抗体芯片用于临床疾病标志物的检验13。1.3.3.2 分子识别单位分子识别单位( molecularrecognition unit，MRU)是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，分子量约为完整抗体的1/80-1/70，可结合抗原，且具有分子量小、穿透力强、半衰期短、显像时本底低等优点，在临床诊断中具有潜在的应用前景。可通过基因工程手段获得。1.4 全人抗体 分子生物学的发展是全人抗体的获得成为可能。目前，转人抗体基因小鼠和噬菌体展示技术为获得该类抗体的方式。近年来，基因编辑等技术取得了重大突破，转基因动物方面的研究也逐渐深入，通过转基因动物获得全人抗体有几种不同的方式。其中一种方式是，将已产生免疫反应的供体患者的淋巴细胞，导入严重联合
