1、实验实验四四 血清血清-球蛋白的提纯球蛋白的提纯 【实验目的实验目的】1.1.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质的基本原理及操作；的基本原理及操作；2.2.掌握离心机的操作；掌握离心机的操作；3.3.熟悉蛋白质定性检测的方法；熟悉蛋白质定性检测的方法；实实 验验 原原 理理【实验原理实验原理】（一）盐（一）盐 析析 法法 定义：定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象使从溶液中沉淀析出的现象。原理原理:破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层 中
2、性盐：中性盐：(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl等等。优点：优点：蛋白质不变性蛋白质不变性，常用常用。（二二）透）透 析析 法法 定义：定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。利用半透膜把大小分子分开的方法。材料：材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。特制的半透膜，截止分子量一般为一万。临床应用：临床应用：血液透析血液透析 （三三）层析法）层析法 待分离物质随待分离物质随(流动相流动相)经过一个固态经过一个固态物质物质(固定相固定相)时，根据溶液中待分离物质时，根据溶液中待分离物质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分颗粒大小、电荷多少及亲
3、和力等，使待分离蛋白组分在两相中反复分配，并以不同离蛋白组分在两相中反复分配，并以不同流速流经固定相实现分离。流速流经固定相实现分离。凝胶层析法凝胶层析法 （四）离心技术（四）离心技术 离心技术离心技术 是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。粒按密度或质量的差异将其分离的方法。沉降速度沉降速度(v)指在强大的离心力作用下，单位时间内指在强大的离心力作用下，单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。物质颗粒沿半径方向运动的距离。v=6.09210-4
4、D2（m）n2r/m D 颗粒直径颗粒直径 颗粒的密度颗粒的密度 m 介质的密度介质的密度 m 介质粘度介质粘度 r 旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离）旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离）N 转子转速转子转速 人血清中几种主要蛋白组分人血清中几种主要蛋白组分 血清蛋白质血清蛋白质 等电点等电点 分子量分子量 占总蛋白的占总蛋白的 清蛋白清蛋白 4.64 69,000 5772 1球蛋白球蛋白 5.06 200,000 25 2球蛋白球蛋白 5.06 300,000 49 球蛋白球蛋白 5.12 90,000150,000 6.512 球蛋白球蛋白 6.857.3 156,00
5、0950,000 1220 【离心操作要领离心操作要领】1 1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形免离心管变形。2 2、精确地平衡离心管及其内容物。、精确地平衡离心管及其内容物。3 3、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置 4 4、启动离心时离心速度由慢到快，当到达离心时间时，、启动离心时
6、离心速度由慢到快，当到达离心时间时，开启减速或速度调节旋钮减速。开启减速或速度调节旋钮减速。（五五）检测蛋白质、检测蛋白质、NHNH4 4+的方法的方法 检测蛋白质检测蛋白质 双二缩脲试剂：溶液显紫红色双二缩脲试剂：溶液显紫红色 2020磺柳酸磺柳酸 ：有白色沉淀产生：有白色沉淀产生 检测检测NHNH4 4+纳氏试剂：黄色或棕色纳氏试剂：黄色或棕色 【实验步骤实验步骤】1.1.盐盐 析析 2.2.透透 析析 3.3.脱脱 盐盐 4.4.检检 测测 1.1.盐析盐析 取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清2ml 加入加入2ml PBS摇匀摇匀 逐滴加入逐滴加入pH7.2饱和饱和(NH4)2SO
7、4 2ml,摇匀摇匀 静止静止10分钟，再离心（分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟 上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白）倾入试管中倾入试管中 沉淀用沉淀用1ml PBS搅拌溶解搅拌溶解 逐滴加饱和逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀摇匀 静止静止10分钟，再离心分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟 倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯化的化的球蛋白球蛋白 脱脱 盐盐 透析透析 2.2.透透 析析 清蛋白清蛋白 换换 水水 透析袋未放入水中时透析袋未放入水中时,立立即取水中液体检查有无即取水中液体检查有无N
8、HNH4 4；放入水中后，每隔放入水中后，每隔4 4分钟分钟检查一次，共检查一次，共3 3次，比较次，比较NHNH4 4透出的情况。透出的情况。约约0.50.5小时，检查袋外液体的小时，检查袋外液体的NHNH4 4；取袋外液取袋外液2 2滴，置于小试管中，滴，置于小试管中，然后滴加然后滴加2020磺柳酸磺柳酸1212滴，观滴，观察有无沉淀产生。察有无沉淀产生。3.3.脱盐脱盐 上样上样 球蛋白，球蛋白，PBS 10PBS 10滴溶解滴溶解 加入洗脱剂加入洗脱剂 PBS 1020ml 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G25，柱，柱 高高1/22/3柱长，柱长，玻璃柱玻璃柱标识的标识的200处。处。
9、流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 收集收集 20滴滴换一换一支试管支试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 每组两块比色板每组两块比色板,洗净备用。洗净备用。一块在各孔滴加纳氏试剂（检测一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NHNH4 4+）,另一块滴加双二缩脲另一块滴加双二缩脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。不用滴管不用滴管,避免污染避免污染,直接用试管倒直接用试管倒 用用“-”表示无现象，用表示无现象，用“+”,“+”,“+”等表示颜色深浅等表示颜色深浅 回收凝胶回收凝胶.层析后洗脱液检测【实验结果实验结果】表表
10、1.层析后洗脱液的显色结果层析后洗脱液的显色结果 表表2.透析后的袋外溶液显色结果透析后的袋外溶液显色结果 试管编号试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 缩二脲试剂缩二脲试剂检测后现象检测后现象 纳氏试剂检纳氏试剂检测后现象测后现象 检测次数检测次数 1 2 3 4 5 6 试试 剂剂 纳氏试剂纳氏试剂 纳氏试剂纳氏试剂 纳氏试剂纳氏试剂 纳氏试剂纳氏试剂 纳氏试剂纳氏试剂 20%磺柳酸磺柳酸 现现 象象 棕色（棕色（+）【注意事项注意事项】.使用离心机的操作注意事项。使用离心机的操作注意事项。.装柱时检查旋钮是否旋紧，是否漏水。装柱时检查旋钮是否旋紧，是否漏水。.装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。柱床装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。柱床面保持有缓冲液。面保持有缓冲液。.层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。.层析时，先用层析时，先用专用移液管专用移液管将将PBSPBS移到小烧杯中，然后移到小烧杯中，然后再用巴氏滴管在层析柱上端加缓冲溶液。再用巴氏滴管在层析柱上端加缓冲溶液。.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样 品交叉污染品交叉污染 金式法测定血清谷丙转氨酶酶活性金式法测定血清谷丙转氨酶酶活性 下次预习要点下次预习要点
