1、实验实验 出凝血检查出凝血检查 上海交通大学医学院 余文红（一）血标本的采取应注意的问题 1.PT、APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。2一般血液采集，进入容器至进行实验所用的时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取出血的做法不可取。3取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉挛缩，止血带的压力要尽可能小，取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平稳地进入注射器，防止气泡的产生。4一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合，一般提倡使用真空采血管。5用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%
2、以内。6.采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。7.国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）推荐使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，因此应根据患者红细胞比例（Hct）状况随时调整抗凝剂用量。（二）应用试剂应注意 的问题 1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数（ISI），为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行。通常在使用前必须充分
3、混匀试剂，以使微粒重新均匀悬浮于液体中。3.试剂准备过程中应该使用去离子水。4.正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起，以弥补个体误差。（三）使用实验器材应注意的问题 1.玻璃器皿的要求：贮存和测试时应选用干净、没有划痕的试管。2.温度的要求：人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在（371），并且周围照明设备要好，便于读取终点。（四）实验操作应注意的问题 1.许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化。2.手工法PT或试管法CT检查时，倾斜试管动作一定要轻，角度要小，以减少血液与管壁的接触面积。3.血液凝固主要是酶催化的反应，所
4、以实验过程中要严格控制理想的pH环境和溶液的离子强度。4.试验结果准确还取决于所用的反应物的量、加入顺序和不同反应物的孵育时间。5.APTT、PT需乏血小板血浆。6.试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。7.报告方式：以PT的秒（s）数报告。以患者PT（s）/正常对照（s）的比（PTR）报告。在口服药物治疗监控时以INR报告。ICSH规定，不再用百分比（活动度）报告。APTT以秒报告。1987年WHO提出PT值用INR（international normalized ratio国际标准化比值）作为PT结果报告形式，并用以作为抗凝治疗监护的指标。INR=病人PT（s）/正常人平均PT
5、（s）ISI PTR=受检者PT（s）/正常对照PT（s）INR=PTRISI ISI：国际敏感指数（international sensitivity index）11.9 CT、PT、APTT、R T、F g、T T 凝 血 时 间 测 定 C T 目的：掌握玻璃试管法凝血时间测定的方法 原理：离体静脉血与玻璃表面接触后，血中XII因子活化并启动内源性凝血途径，最终生成纤维蛋白而使血液凝固所需的时间。器材：6mm直径玻璃试管3支 静脉采血器材 37恒温浴箱 秒表 步骤：3支试管各1ml血，每隔0.5min倾斜，第一管计时后，立即观察第二、三管并计时，直至血液凝固。结果判断：从血液刚进入注射
6、器至第3管凝固所需时间即为凝血时间。正常参考值：412分钟 报告方式：CT X.Xmin（玻璃试管法）注意事项：试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”且血液中不含泡沫。温度恒定为37，倾斜试管角度应在30左右。评价：凝血时间曾用玻片法测定，但由于毛细血管采血，易混入组织液而使凝血时间正常，属于淘汰方法。延长：严重内源性凝血途径凝血因子有缺陷；血中抗凝物质增多；肝素治疗 缩短：高凝状态（DIC早期）凝 血 酶 原 时 间 P T 原理：在乏血小板血浆中加入组织因子和钙离子（钙凝血活酶）后，血浆发生凝固的时间即为凝血酶原时间（PT）。步骤：取空腹静脉血1.8ml加入含有0.2ml109mmol/L枸橼
7、酸钠的试管中混匀备用。抗凝血以3000r/min离心10min分离血浆 将试剂、正常人混合血浆、待测血浆与37预热5min。血浆0.1ml加入混匀的试剂0.2ml，开动秒表计时。正常参考值：PT：1113秒 PTR：10.15 INR：0.81.5 报告方式：PT：X.Xs，正常人血浆X.Xs PTR：X.X INR：X.X 注意事项：试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”，抗凝剂与血液比例（1：9）应准确。取血后4h内完成测定。钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。标本测定前应先测定正常人混合血浆，其PT值在允许范围内才能测定样本。评价：血浆凝血酶原是一种筛选试验
8、，是用来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相应抑制物的存在，也用于监测口服抗凝治疗时引起的凝血酶原和因子VII、X水平的下降。实质：对检测样本（血浆）中存在凝血激酶时的再钙化反应，这种过程包括了因子VIIa、组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶原的活化，凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白单体的聚集交联。活化部分凝血活酶时间测定 APTT 原理：用白陶土激活XII因子、脑磷脂代替血小板磷脂，测定乏血小板血浆加入Ca2+后凝固所需时间。步骤：采血 空腹静脉血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸橼酸钠混匀。分离血浆 3000r/min离心10分钟分离血浆。溶解试剂
9、临用时加1ml蒸馏水，室温静置15min以上，混匀后使用。预温活化 0.1ml血浆+APTT试剂0.1ml混匀，37准确孵育3min（其间轻轻摇动数次）加钙计时 加入0.1ml 25mmol/L CaCl2混匀并立即开动秒表计时，20s后，观察混合液流动状态。正常参考值：一般在33.6840.32s（不同仪器和试剂所测之参考值有差别）报告方式：APTT：XX.Xs，正常人血浆：XX.Xs 注意事项：采血时穿刺尽量一针见血，不要淤血和气泡，采血后立即与抗凝剂混合，尽快送往实验室。使用枸橼酸盐（抗凝）血浆 如果不能立即测试，应尽快分离血浆，盛血浆的容器加塞，防止PH值改变 血浆在28下保留7天 钙
10、凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。临床意义：APTT延长：表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷（血友病）和纤维蛋白原缺乏。纤维活力增加，如继发性，原发性纤溶以及血循环中有纤维蛋白（原）降解产物（FDP）。血循环中有抗凝物质。APTT缩短：高凝状态，如DIC的高凝期，促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等。评价：APTT和PT同时检测是目前二期止血缺陷的主要筛选试验组合。在有临床出血症状的前提下：APTT PT 提示 正常 延长 因子VII的缺陷 延长 正常 因子VIII、IX、XI缺陷 正常 正常 怀疑因子XIII缺陷可能 延长 延长 除因子II、V、I、X缺
11、陷 外，主要是异常抗凝物质 的增多 血浆复钙时间 RT 原理：在去钙离子的抗凝血浆中，重新加入适量的钙后，血浆发生凝固。步骤：0.2ml 0.1mol/L草酸钠+静脉血1.8ml混匀，离心分离血浆。0.1ml血浆置37水浴中，+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立即开动秒表记录时间。正常参考值：2.080.49分（2.183.77分钟）注意事项：不要溶血，否则时间缩短 CaCl2新鲜配制 分离血浆以1000转/分为宜，高速离心可使大量血小板下沉而导致复钙时间延长。复钙交叉时间 RT 步骤：按下列比例准备5份待测血浆：加样量 1 2 3 4 5 受检血浆（ml）0.01 0.05 0
12、.09 0.10 正常血浆（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 上述试管，置37 1min，加0.025mol/LCaCl2 0.1ml，混匀后，记录血浆凝固时间。注意事项：所用血浆均为富含血小板血浆，分离出血浆后需在2h内检测完毕。临床意义：RT最早作为内源性凝血系统相关凝血因子缺陷的筛选检查，但由于这个试验不如APTT，又容易受血小板数量和功能影响，目前只用来筛选是否存在病理性抗凝物质增多。延长的复钙时间如被1/10量的正常血浆所纠正，则表示受检血浆中缺乏内源凝血因子；如不被少量正常血浆纠正，提示存在异常抗凝物质。血浆纤维蛋白原 Fg 纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大类：基
13、于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即可凝固蛋白法。物理、化学测定法。免疫学测定法。目的和原理 为了解凝血途径最后环节的状况，排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选试验的影响，了解纤溶活动度等可选择本试验。Clauss法以凝血酶作用于受检血浆中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白，血液凝固。纤维蛋白原的量与凝固时间成负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。步骤：将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1：2、1：4、1：8、1：16稀释5管。取稀释血浆0.2ml于小试管中，置37水浴预热2分钟，再加凝血酶溶液0.1ml，记录时间。相关分析：首先先清除内存。INV+AC，浓度（log或I
14、n）XD，YD输入（如不取对数，浓度直接输入XD，YD 读取值DATA输入；全部数据输入完毕，按INV+9读出相关系数r。待测读数INV+log或In读出相关浓度。如不取对数，待测读数直接INV+x读出相关浓度。最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。标准曲线：t（s）25 20 15 10 5 0 0.5 1 1.5 2 2.5C（g/L）如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。低于0.8 g/L时，需将原血浆改为12或15稀释，在标准曲线上查得结果后，除以5或除以2。正常参考值：24mg/ml 临床意义：纤维蛋白原增高除生理情况下的应激反应、妊娠后期外，主要出现感
15、染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、败血症等。纤维蛋白原减少见于DIC、原发性纤溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶栓治疗时。评价：Clauss方法测定的是纤维蛋白原功能，因此需纤维蛋白原结构正常，且有一定的含量，对低（无）纤维蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血症应改用ELISA和RIA等免疫检测手段。主要误差来源：血浆稀释不准。凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料(聚乙烯)试管中，置4可保存活性24小时。测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往很快即凝固，手工法重复性较差，不易做准。血浆凝血酶时间TT 原理 以标准凝血酶溶液加入受检血浆，使凝血酶裂解血浆中的纤维蛋白原，形成纤维蛋白，造成血浆凝固，此时所需时间为凝血酶时间。方法：0.1ml血浆+0.1mlTT试剂，37水浴中观察凝固时间。正常参考值：1618S 评价：时间大于正常参考值3秒：DIC、肝脏病变。TT时间缩短，并不代表高凝状态或DIC前期，是技术原因。如操作失误，组织液混入血标本，标本在4环境中放置过久。
