1、 血片制作和染色血片制作和染色 李金凤李金凤 平乐县中医医院平乐县中医医院 人体疟原虫的基本结构人体疟原虫的基本结构 细胞浆细胞浆 随虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。随虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到大滋养体阶段，胞浆呈间日疟原虫发育到大滋养体阶段，胞浆呈阿米巴样活动，胞浆内有空泡。阿米巴样活动，胞浆内有空泡。核核 鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配子体的核。有时松，例如间日疟原虫雄配子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗红或紫因胞浆厚密或染色深蓝，
2、使核呈暗红或紫红色。红色。人体疟原虫的基本结构人体疟原虫的基本结构 疟色素疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色素颗粒呈细小杆状，黄褐色；恶性疟素颗粒呈细小杆状，黄褐色；恶性疟原虫色素呈块状，黑褐色；三日疟原原虫色素呈块状，黑褐色；三日疟原虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与间日疟原虫相似。疟色原虫的色素与间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。素在虫体内散在分布或聚集成团块。设设 备备 载玻片载玻片 新玻片新玻片 把玻片浸入有液态洗涤剂清水中把玻片浸入有液
3、态洗涤剂清水中1020分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再放入盛有清水的容器中换水再放入盛有清水的容器中换水34次，凉次，凉干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊目的玻片，上述处理后将玻片浸用于特殊目的玻片，上述处理后将玻片浸在在95乙醇乙醇510分钟，再擦干擦亮。分钟，再擦干擦亮。设设 备备 旧玻片旧玻片 将玻片浸泡于洗涤剂溶液中将玻片浸泡于洗涤剂溶液中12天，或浸泡于煮沸的天，或浸泡于煮沸的5肥皂水肥皂水12小小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中时，再移到新配置的洗涤剂溶液中12小时，擦去玻片上的血痕，用清水漂小时，擦去玻片上
4、的血痕，用清水漂洗洗34次，再将玻片擦干擦亮。次，再将玻片擦干擦亮。玻片包装玻片包装 洗净的玻片每洗净的玻片每1020张用白张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。境中备用。设设 备备 采血针采血针 使用一次性采血针。使用一次性采血针。玻片盒玻片盒 为防止污染和苍蝇吸食血膜，为防止污染和苍蝇吸食血膜，新血片应放在玻片盒内，厚血膜要保新血片应放在玻片盒内，厚血膜要保持水平，直到充分干燥。持水平，直到充分干燥。75乙醇棉球乙醇棉球 用于采血前后消毒。用于采血前后消毒。记号笔记号笔 用于记录血片号码。用于记录血片号码。试试 剂剂 染色液种类染色液种类 以碱基美
5、蓝液和酸性伊红液以碱基美蓝液和酸性伊红液混合的多色性染剂（美兰、伊红和由美混合的多色性染剂（美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青）配制的多色性染液兰氧化所成的天青）配制的多色性染液分为两类：分为两类：水溶液：罗氏（水溶液：罗氏（Romanowsky）染液、西）染液、西氏（氏（Simon)、J.S.B氏染液、费氏氏染液、费氏(Field)等；等；醇溶液：吉氏（醇溶液：吉氏（Giemsa）染液、瑞氏）染液、瑞氏（Wright）染液、利氏（）染液、利氏（Leishman）等。）等。试试 剂剂 染色原理染色原理 伊红是酸性水溶性钠盐，美兰伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化是碱性水
6、溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质（如血红蛋白、嗜伊红白碱性的蛋白质（如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等）可结合成不易溶于水的沉血球颗粒等）可结合成不易溶于水的沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的阴离子，美兰与疟原虫、淋巴和大单核阴离子，美兰与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。性蛋白质结合染成兰色。试试 剂剂 吉氏（吉氏（Giemsas）染液配制）
7、染液配制 吉氏粉吉氏粉 5.0 g 甲醇甲醇 250ml 甘油甘油 250ml 将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至加完甘油倒入分研磨，然后边加边磨，至加完甘油倒入500ml有塞玻璃瓶。在研钵中加入少量甲有塞玻璃瓶。在研钵中加入少量甲醇洗掉剩余部分倒入瓶内，再加甲醇洗静醇洗掉剩余部分倒入瓶内，再加甲醇洗静研钵中甘油。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室研钵中甘油。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液温内，每天用力摇动溶液5分钟，分钟，3天后即天后即可使用。可使用。试试 剂剂 瑞氏（瑞氏（Wrights）染液配制）染液配制 瑞氏染剂粉瑞氏染剂
8、粉 1.0 g 甲醇甲醇 500ml 甘油甘油 15ml 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗研钵中的甘油，溶液倒入瓶用甲醇洗研钵中的甘油，溶液倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分分钟，钟，3天后即可使用。天后即可使用。试试 剂剂 染色用水染色用水 常用的染液稀释和冲洗用水常用的染液稀释和冲洗用水是中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。是中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。在没有蒸馏水时，也可用井水、河水、在没有蒸馏水时，也可用井水、河水、泉水或雨水。稀释和冲洗用水的泉水
9、或雨水。稀释和冲洗用水的pH值值在在7.0-7.2染色效果最佳。也可选用临染色效果最佳。也可选用临时配制的时配制的PBS缓冲液，作为稀释和冲缓冲液，作为稀释和冲洗用水。洗用水。试试 剂剂 PBS缓冲液配制缓冲液配制（0.01 mol/l PBS pH7.2）KH2PO4 0.38g NaHPO4 1.02g(或或Na2HPO4 12H2O 2.58g)NaCl 8.00g 蒸馏水加至蒸馏水加至 1 000ml 血片制作血片制作 取血时机取血时机 现症病人随时取血现症病人随时取血，疟疾普查疟疾普查不考虑取血时机不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟但在诊断或需要某期疟原虫作标本时原虫作标本时，应掌
10、握适宜的取血时机应掌握适宜的取血时机。一般一般患者发作数小时至十小时内患者发作数小时至十小时内，可见可见环状体环状体,12123636小时小时发育至滋养体发育至滋养体，3636 4848小时小时可见裂殖体可见裂殖体，发作二次可见配子体发作二次可见配子体。恶性疟原虫裂体生殖在内脏毛细血管内恶性疟原虫裂体生殖在内脏毛细血管内进行进行，发作前末稍血液中不易查到发作前末稍血液中不易查到。较理较理想的取血时间是在发作后想的取血时间是在发作后2020小时左右小时左右，初初发患者退热后常查不到原虫发患者退热后常查不到原虫。采血部位和方法采血部位和方法 通常耳垂取血，先通常耳垂取血，先用用75%75%酒精棉球
11、消酒精棉球消毒取血部位，待酒毒取血部位，待酒精干后，用左手拇精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒上方，右手持消毒针迅速刺入皮肤，针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。不宜过深或过浅。然后用右手中指轻然后用右手中指轻轻挤压出血。轻挤压出血。厚血膜厚血膜用右手大拇指和食用右手大拇指和食指夹持推片两侧中部，指夹持推片两侧中部，用推片左下角从取血部用推片左下角从取血部位刮取约位刮取约45l血，使血，使血滴与载玻片接触再由血滴与载玻片接触再由里向外一个方向旋转里向外一个方向旋转24圈，涂成直径圈，涂成直径0.81圆圆形厚血膜。形厚血膜。薄血膜薄血膜用推片中部取血用推片中部取血11.
12、5l，将推片与载玻，将推片与载玻片片2535度角接触，当血度角接触，当血液在两侧扩展至约液在两侧扩展至约2 宽宽时，迅速向前推成长时，迅速向前推成长2.5 2.5 舌状薄血膜。舌状薄血膜。厚、薄血膜的位置厚、薄血膜的位置 厚薄血膜标本片厚薄血膜标本片 厚血膜厚血膜血量适宜血量适宜，不宜过多或过少不宜过多或过少。薄薄血膜血膜无皱折和空泡，红细胞单层排列无皱折和空泡，红细胞单层排列。染染 色色 吉氏染色吉氏染色 先用甲醇固定薄血膜先用甲醇固定薄血膜。成批染色成批染色时时，将血膜朝一方向插入染色缸中将血膜朝一方向插入染色缸中，倒入倒入新配制新配制2吉氏染液浸没厚薄血膜染色吉氏染液浸没厚薄血膜染色30
13、分钟分钟，向染色缸中缓慢注入自来水至溢出向染色缸中缓慢注入自来水至溢出，将染色缸中残余染液倾出将染色缸中残余染液倾出，再加入新水反再加入新水反复冲洗复冲洗23次次，然后取出血片然后取出血片，将血膜朝将血膜朝下插在晾片板上晾干下插在晾片板上晾干。单张血膜染色单张血膜染色 可可取蒸馏水或取蒸馏水或PBS缓冲液缓冲液2ml加入吉氏染液加入吉氏染液12滴滴，混匀后滴在厚薄血膜上染色混匀后滴在厚薄血膜上染色20 30分钟分钟，再按上述方法水洗再按上述方法水洗、晾干晾干。快快 染染 配制配制5%5%吉氏染液吉氏染液 在在2ml2ml缓冲液缓冲液或净水中直接滴加吉氏原液或净水中直接滴加吉氏原液7 7滴，混滴
14、，混匀，滴到待染标本的厚薄血膜上，匀，滴到待染标本的厚薄血膜上，染色染色10min10min，清水缓慢冲洗，晾干镜，清水缓慢冲洗，晾干镜检。检。影响染色效果的因素影响染色效果的因素 血片血片 玻片清洁玻片清洁，血膜制作质量血膜制作质量。染剂和溶剂染剂和溶剂 染料染料溶剂溶剂质量质量影响影响染液酸碱染液酸碱度。度。染液染液 新配制染液染色力较弱且常呈碱性。新配制染液染色力较弱且常呈碱性。染液浓度染液浓度 染液浓度高，着色快，着色深；染液浓度高，着色快，着色深；浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰。着色均匀、清晰。染色时间染色时间 温度高温度高，着色快
15、，染色时间短着色快，染色时间短；温度低温度低，着色慢，染色时间适当延长。着色慢，染色时间适当延长。影响染色效果的因素影响染色效果的因素 稀释和冲洗用水稀释和冲洗用水P PH H值值 稀释和冲洗用水稀释和冲洗用水P PH H偏低，染色偏红；偏低，染色偏红；P PH H偏高，染色偏蓝。偏高，染色偏蓝。冲洗方法冲洗方法 染色后将玻片连同染液一起放染色后将玻片连同染液一起放在水中在水中缓慢缓慢漂洗，或沿玻片及染色缸边漂洗，或沿玻片及染色缸边缘缘缓慢缓慢加水加水，使染液表层溢出，并轻轻使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。染色效果的判定染色效果的判定 染色
16、着色较好的血膜，红细胞呈染色着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈兰色色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈兰色或淡蓝色，白细胞核呈紫蓝色，疟或淡蓝色，白细胞核呈紫蓝色，疟原虫核呈红色。原虫核呈红色。血片制作染色注意事项血片制作染色注意事项 1.1.编号编号 血膜制成后用蜡笔在玻片上写受检血膜制成后用蜡笔在玻片上写受检者号码，待薄血膜干后用铅笔于薄血膜者号码，待薄血膜干后用铅笔于薄血膜上写受检者的号码。上写受检者的号码。2.推片推片 制血片时手指持玻片边缘，不接触制血片时手指持玻片边缘，不接触玻片表面。用作推片的玻片边缘要平滑。玻片表面。用作推片的玻片边缘要平滑。3.新血片存放新血片存放 刚涂制的血膜平放在标本盒刚涂制的血膜平放在标本盒内，防尘、防苍蝇、蟑螂吮吸血膜，血内，防尘、防苍蝇、蟑螂吮吸血膜，血膜干后盖严标本盒。新木制标本盒不能膜干后盖严标本盒。新木制标本盒不能马上存放标本，以免厚血膜血红蛋白被马上存放标本，以免厚血膜血红蛋白被木醇固定。木醇固定。血片制作染色注意事项血片制作染色注意事项 4.4.未染色血片存放未染色血
