1、2023年2月26日星期日 清洁分析方法验证 苏芳 清洁验证的背景：FDA历来的检查重点：过去FDA 总是更注意检查青霉素类与非青霉素类药物之间的交叉污染、药品与甾类物质或激素之间的交叉污染问题。在过去二十年间，因实际或潜在的青霉素交叉污染问题已从市场上撤回了大量的药品。有一位幼儿教师，怀抱着一名2小时前注射过青霉素钠的婴儿，孩子的一泡尿撒在了幼儿教师的手臂上，1分钟后该名幼儿教师呼吸困难、面色苍白、心慌气短，不一会就呈现昏迷状态，经医生诊断为青霉素过敏。欧盟GMP关于清洁的要求 36.为确认清洁规程的效力，应进行清洁验证。应根据所涉及的物料，合理的确认产品的残留、清洁剂和微生物污染的限度标准
2、。这个限度标准应该是可以接受的，能够被证实的。37.应该使用经验证、检出灵敏度高的检验方法来检测残留或污染物。每种分析方法或仪器的检测灵敏度应足以检测出设定合格限度水平的残留或污染物。欧盟GMP关于清洁的要求 38.通常只有接触产品的设备表面的清洁规程需要验证。某些场合下，还应考虑不直接接触产品的部分。应验证设备使用与清洁的间隔时间,以及已清洁设备可保留的时间（即清洁有效期），并通过验证确定清洗的间隔时间和清洁的方法。39.对于相似产品和相似工艺而言，可从相似产品及工艺中，选择一个具有代表性的产品和工艺进行清洁验证。可以采用“最差条件”的方法进行单独的验证试验，在验证中应考虑关键因素（取样部位
3、、取样方法、清洗剂等）欧盟GMP关于清洁的要求 40.为证明方法是经过验证的，通常应在3个连续批上使用该清洁规程，并检验合格。42.如果实际产品是有毒物质或有害物质，在清洁验证中，可以例外的采用物化性质相似的无毒无害物质来模拟。FDAFDA的要求：的要求：在FDA的cGMP 211.67章节 中规定了设备清洗验证的要求。建立书面标准操作程序（SOP），其中必须详细规定设备各部件的清洗过程。必须建立书面的清洗方法验证通则。清洗方法验证通则应规定执行验证的负责人、批准验证工作的负责人、验证标准（合格标准）、再验证的时间。对各生产系统或各设备部件进行清洗验证之前，应制定专一特定的书面验证计划，其中应
4、规定取样规程、分析方法（包括分析方法的灵敏度）。内容介绍 1.标记化合物的选择及限度计算 2.清洁方法的开发和设计 3.清洁分析方法（HPLC）的验证 4.HPLC法与TOC法比较 一、标记化合物的选择 一般药品都由活性成分和辅料组成。对于接触多个产品的共用设备，所有这些残留物都是必须清洁干净的，在清洁验证中不必为所有残留物都制定限度标准并一一检测，因为这是不切实际且没有必要的。在一定的意义上，清洁的过程是个溶解的过程，因此，通常的做法是从各组分中确定最难清洁(溶解)的物质，以此作为参照物质。通常，相对与辅料，人们最更关注活性成分的残留，因为它可能直接影响下批产品的质量、疗效和安全性。一、标记
5、化合物的选择（续）毒性 在清洗溶剂中的溶解度 清洗问题如：对设备表面材质有一定的附着力 包含色料、芳香剂或矫味剂的产品 设备的使用率（生产频率高的产品相应的清洗频率也高）清洗过程中如果使用清洗剂，则其残留物也应视为标记物 一、标记化合物的选择（续）目标化合物选择：A D 化学残留限度计算：浓度限度：十万分之一（10ppm）在下一产品中的残留物数量级别应不超过十万分之一（10ppm）设下批产品的生产批量为B(kg)，因残留物浓度最高为10106，即10mgkg，则残留物总量最大为B1010610B(mg)；单位面积残留物的限度为残留物总量除以测量的与产品接触的内表面积，设设备总内表面积为SA(c
6、m2)，则表面残留物限度L 为10BSA(mgcm2)。化学残留限度计算：（续）千分之一残留限度的计算 MTDa=清洗前产品最小每日给药剂量中的活性成分含量；Nb=清洗后产品的批量；MDDb=清洗后产品的最大日给药剂量的活性成分含量；Sb=清洗后产品活性成分含量的百分比(%w/w)。数据1/1000来源：一般认为药物的十分之一处方剂量是无效的。SbMDDbNMTDaLb10001000/1二、清洁方法的开发和设计：清洁方式选择 通常清洁方法分为:手工清洁（Manual Cleaning）在线清洁（Cleaning In Place）在线清洁的特点：1.设备、容器、管道能够自动进行清洗；2.对容
7、器采用喷林法清洁，对管道采用压力法清洁；3.极少的手工操作，重复性高。二、二、清洁方法的开发和设计清洁方法的开发和设计:清洁剂的选择清洁剂的选择 1.清洁剂应能有效溶解残留物，不腐蚀设备，且本身易被清除。2.人用药品注册技术要求国际标准协调会(ICH)在“残留溶剂指南”中将溶剂分为3个级别，对其使用和残留限度有明确的要求。3.随着环境保护标准的提高，还应要求清洁剂对环境尽量无害或可被无害化处理。4.满足以上要求的前提下应尽量廉价。二、二、清洁方法的开发和设计清洁方法的开发和设计:清洁剂的选择（续）清洁剂的选择（续）根据这些标准，对于水溶性残留物，水是首选的清洁剂。不同批号的清洁剂应当有足够的质
8、量稳定性。因此不宜采用一般家用清洁剂，因其成分复杂、质量波动较大且供应商不公布详细组份。因此，应尽量选择组份简单、成分确切的清洁剂。根据残留物和设备的性质，企业还可自行配制成分简单效果确切的清洁剂，如一定浓度的酸、碱溶液等。企业应有足够灵敏的方法检测清洁剂的残留情况，并有能力回收或对废液进行无害化处理。取样方法和取样点的确认：通常设备的取样清洁验证中如何确定合适取样方法和取样点是验证方案的关键内容之一，必须由合适的理由来确认取样点，此取样点应能够代表设备的“最脏点”。（1）取样方法的选择 直接表面擦拭直接表面擦拭 淋洗液冲洗淋洗液冲洗 浸泡液取样浸泡液取样 取样方法和取样点的确认：擦拭取样优点
9、：是能对最难清洁部位直接取样，通过选择适当的擦拭溶剂、擦拭工具和擦拭方法，可将清洗过程中未溶解的，已“干结”在设备表面或溶解度很小的物质擦拭下来。检验的结果能直接反映出各取样点的清洁状况。擦拭取样缺点：是很多情况下须拆卸设备后方能接触到取样部位，对取样工具、溶剂、取样人员的操作等都有一定的要求。取样方法和取样点的确认：淋洗取样法优点淋洗取样法优点：是取样面大，对不便拆卸或不宜经常拆卸的设备也能取样。因此其适用于擦拭取样不易接触到的表面，尤其适用于设备表面平坦、管道多且长的的生产设备。淋洗水取样缺点：淋洗水取样缺点：溶解与流体力学原理，当溶剂不能在设备表面形成湍流进而有效溶解残留物时，或者残留物
10、不溶于水或“干结”在设备表面时，淋洗水就难以反映真实的情况。取样方法和取样点的确认：（2）取样点的确认 通常不可能擦拭设备的全部表面，因此应该选择设备的最差区域作为取样点。这些区域应在清洁难度和残留水平方面代表着对清洁规程最大程度的挑战，例如料斗的底部、桨拌桨桨叶底部和阀门的周围。三、清洗分析方法验证的内容：专属性 线性 范围 准确度 精密度（重复性、中间精密度、重现性）检测限（LOD）和定量限（LOQ）药品溶液的稳定性 专属性：通常在进行清洁分析时，即使活性成分的样品（如：取样棉签、淋洗溶液）中的含量也很低，所以在进行专属性验证时无需考虑正常产品中的杂质，降解产物的影响，只需考虑辅料及空白溶
11、剂的影响。专属性的试验方法：1.预先按处方比例配制足够量的辅料混合物，研磨均匀。2.按照试验方法配制一定浓度（浓度来自于：标记化合物的理论限度浓度）的标准溶液。3.精密称量同标准溶液中所用标准品成比例的辅料混合物，按照标准品溶液的配制方法配制。过滤后使用。专属性的接受标准：1.应当证明潜在的干扰成分不会对方法的性能产生副作用。对于色谱检测方法，要求证实杂质之间、杂质与主峰之间的分离度1.0。2.空白空白对照应无干扰。线性与范围：线性与范围：线性是定量测定的基础，所以定量清洗分析方法需要进行线性验证而定性清洗分析方法无法进行线性验证。可用一贮备液经精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品进行测
12、定，至少制备5个浓度（通常选取50%、80%、100%、120%和150%），另外需要将定量限加入到线性中。精密度：1.重复性 重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的接近程度。精密度：重复性的评价：在方法规定的线性范围内至少测定9次（如3个浓度级别80%，100%和120%，或者30%，50%和100%；每个浓度级别测定3次）或者在100%的试验浓度，至少测定6次。可接受标准：定量清洗分析方法验证时，活性成分的RSD10%。2.中间精密度：系指同一实验室不同日期、不同仪器、不同分析人员对同一样品、采用同一方法处理样品所得结果之间的接近程度。验证方法：同一样
13、品每位分析人员准备6份进样测量，计算两人之间的平均值的差异。可接受限度：平行六份样品的RSD10%，两人之间的平均值之差的相对值10%。准确度试验：棉签取样回收率试验 淋洗取样回收率试验 浸泡法取样回收率试验 清洗回收率：棉签取样方法验证 取样棉签种类、规格、品牌等；溶解用溶剂；取样人员的操作；样品的溶出。棉签取样方法清洗回收率 准备一块与设备表面材质相同的板材，如平整光洁的316L不锈钢板；在钢板上划出100mm100mm的区域；将5倍限度量的的待检测物溶液，定量装入校验的微量注射器；将其溶液尽量均匀的涂布100mm100mm的区域内；自然干燥或用电吹风温和的吹干不锈钢板；棉签取样方法清洗回
14、收率 用选的的擦拭溶剂润湿擦拭棉签，按下图所示进行擦拭取样；第一步 第二步 棉签取样清洗回收率 重复以上规程3次；将擦拭棉签分别放入棉签管中，加入预定的溶剂5ml，超声；依法分析，计算回收率和回收率的RSD 棉签取样方法清洗回收率 总结：取样过程需经过验证，通过回收率试验验证取样过程的回收率和检验方法回收率结合进行。接受标准：总回收率一般（企业可以根据实际情况确定）不低于70%，多次取样回收率的相对标准偏差应不大于20%淋洗法清洗回收率：淋洗溶剂选择 溶解度；同设备内表面的相容性；易清除性；毒性；环境的危害性；获取的难易性。清洗回收率淋洗法 淋洗溶剂或淋洗水的淋洗速度选择：淋洗法清洗回收率试验
15、方法：选择同生产设备材质相同的平板，划出10cm*10cm区域，在该区域内均匀涂抹一定量（取决于分析方法的测量范围的下限乘以清洗所有溶液的体积）的标记化合物，待干燥后，使用一定体积的淋洗溶剂，采用一定速度冲洗平板，收集全部淋洗液，如有必要可以重复清洗过程。待冲洗完成后，吸取一定体积的淋洗液进行测试，并计算回收率。清洗回收率淋洗法 接受标准：回收率通常应不低于95%；外观检查即清洗后的淋洗溶液样品同淋洗前的淋洗液做视觉检查，确定是否有颜色差异和异物存在；如果有上述现象发生，可直接判断样品不合格。注意：淋洗法样品可对冲洗液直接检测，也可对稀释/浓缩后检测。检测限和定量限：检测限检测限系指在确定的试
16、验条件下，试样中的被测物能被检查的最小量；定量限定量限系指在确定的试验条件下，试样中被测物能被准确测定的最小量，其检测结果应具有一定准确度和精密度。检测限和定量限：1.信噪比法：该方法适用于出现噪音的分析方法。性噪比的测定时通过比较含已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测试信号，确定被分析物可被确切的检测的最小浓度，典型的性噪比为3:1；对于定量限典型的信噪比为10:1。检测限和定量限：2.根据相应值的标准差和斜率 检测限：LOD=3.3/S+空白值 定量限：LOQ=10/S+空白值 其中：为响应值的标准差；S为校正曲线的斜率；S可从被分析物的校正曲线来估算；的值可由多种途径估算，如：1.测定背景10次以上，求出标准偏差。2.将乘以3.3倍。3.在工作曲线上求出3.3 相对应的浓度X。该浓度X即为该方法的检测限 样品溶液的稳定性：通常样品应按照具体情况选择室温或冷藏放置824小时，比较供试品中目标化合物的浓度变化。测定结果不低于初始值的90%，则溶液稳定较好。如果溶液在放置过程中降解明显，应及时检测，尽量缩短放置时间或冷藏储存。谢 谢！
