1、课题3 血红蛋白的提取和分离 思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考思考3 高
2、温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构 思考思考4 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取，人的红细胞无的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。富便于提取血红蛋白。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色
3、谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），
4、移动速度（度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小 较长较长 较慢较慢 相对分子质量较大相对分子质量较大 凝胶外部凝胶外部 较短较短 较快较快 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从
5、色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物 上上 柱柱 洗洗 脱脱 大分子流动快大分子流动快 小分子流动慢小分子流动慢 收收 集集 大分子大分子 收收 集集 小分子小分子 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液）的对溶液的（的（）的影响，维持）的影响，
6、维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱 PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12 使用比例使用比例 在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4 H2CO3 /NaHCO3 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是
7、磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性）1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用不同，在电场中受到的作用力力大小、方向、阻力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在不同，导致不同蛋白质在电场中的电场中的运动方向运动方向和和运动速度运动速度不同不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳：电泳
8、：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可解离的基团会带上电荷，蛋白质可解离的基团会带上电荷 电泳：电泳：影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定 运动方向运动方向 电场电场 作用力作用力 形成形成 阻力阻力 决定决定 运动速率运动速率 电荷性质电荷性质 电荷量电荷量 分子形状分子形状 分子大小分子大小 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分差异以及分子本身的大小，
9、形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离子的分离 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电团会带上正电或负电 1、原理：、原理：聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,NN,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫过
10、硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶聚合交联成三维网状结构的凝胶 测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量 2、常见方法、常见方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素 原理原理 SDSSDS作用作用 为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响净电荷对
11、迁移率的影响可以在凝胶可以在凝胶中加入中加入SDS,SDS,SDS所带负电荷的量大大超过了所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小于分子的大小 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝 胶电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量 应用应用 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽
12、链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS 单条肽链的分子量单
13、条肽链的分子量 分子的大小分子的大小 电泳检测电泳检测PCR结果结果 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 二二 实验操作实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理 血血液液 血浆血浆 水分水分 固体物质固体物质 血浆蛋白血浆蛋白 无机盐无机盐 磷脂磷脂 葡萄糖等葡萄糖等 血细胞血细胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链 两个两个 一肽链肽链 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 共四条肽链共四条肽链 90 目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度
14、越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（每个肽链环绕（），此），此基团可携带（基团可携带（）。）。血红蛋白因含有（血红蛋白因含有（）而呈红色。本课）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳 血红素血红素 (
15、1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤 杂质蛋白杂质蛋白 低速短时间低速短时间 黄色血浆黄色血浆 暗红色暗红色 烧杯烧杯 再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为质量分数为0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤 低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）重复重复4、5步骤（步骤（）次，直至上清）次，直至上清液中已没有（液中已没有（），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。涤次数过少。五倍体积五倍体积 生理盐水生理盐水 三三 黄色黄色(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体
16、积的（）（）（溶解细胞溶解细胞膜膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液 甲苯甲苯 磁力搅拌器磁力搅拌器 蒸馏水蒸馏水 第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层 第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体 第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层 无色透明无色透明 脂溶性物质脂溶性物质 白白 血红蛋白血红蛋白 红色透明红色透明 暗红色暗红色 用滤纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透明液体液体。取取()ml的血红蛋白溶液
