1、神经细胞培养 第一节：细胞培养的基本知识第一节：细胞培养的基本知识 1定义：组织培养 (Tissue culture)：细胞培养 (cell culture)：器官培养(organ culture)：统称为体外培养 （In vitro)2 组织或细胞培养的优点：1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制 3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的费用相对比较经济 6）：可作为一些遗传物质的运载细胞 7)：干细胞的广泛应用前景 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异；2）细胞培养存在一定的不稳定性 培养细胞学的研究内容 1 培养细胞
2、学在病毒学中的应用 2 细胞生物学的基础研究:细胞培养使细胞生物学迅速发展 3 细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。4 干细胞的培养及应用 5 淋巴细胞培养技术的应用 6 遗传性疾病的产前检查 7 细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具 8 细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测序与表达，基因转移与重组，癌基因的研究等。4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式：a 贴附生长型细胞（大多数）b 悬浮生长型细胞（少数）2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性 5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要：a 基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水
3、化合物及一些无机离子；b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境：a 温度：哺乳动物和人类为3537；鸟类为38.5 b 气相及PH 值：O2及CO2的值：CO2=5%；PH=7.27.4 c 渗透压：260320m mol/L 3)无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！无毒：与细胞直接接触者培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等；间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染：微生物及交叉污染，（霉菌污染常见）6 常用的培养用液及培养基常用的培养用液及培养基 培养用液：水 平衡盐溶液（）（见表）作用：消化液胰蛋白酶液（%）二乙烯四乙酸二钠（）胶原酶：甘氨酸 羟脯氨酸敏感 培养基：
4、1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）2 合成培养基（S F12 （）等 常用的平衡盐溶液（g/L）Ringer(1985)PBS Eargle(1948)Hanks(1949 Dulbecco(1954)D-Hanks NaCl KCl 900 042 800 020 680 040 800 040 800 020 800 040 CaCl2 MgCl.6H2O MgSO4.7H2O 025 020 020 014 020 110 010 Na2HPO4.H2O 156 006 006 Na2HPO4.2H2O KH2PO4 020 114 006 242 020 006 NaH
5、CO3 葡萄糖 酚红 320 100 002 035 100 002 002 035 002 细胞计数法：原则：取0.1 ml细胞悬液 加 Hanks 液0.9ml，混匀后滴于血细胞计数板上，在低倍显微镜下计数四角大方格内细胞。计数过程中对于大方格边缘压线按照数上不数下，数左不数右的原则。细胞浓度=4个大方格内细胞数 4 104 稀释倍数 =细胞数/ml 细胞活性的检查 台盼蓝染色：0.2 ml 细胞悬液加0.4 ml台盼蓝溶液混合，滴少许于载波片上，低倍镜计数200细胞，算比率，正常不着色，死细胞为兰色 细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/总细胞数100%第第 二节：神经细胞体外培二节
6、：神经细胞体外培 养的养的 基本概念和方案基本概念和方案 神经细胞培养的类型 1 原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。2 细胞系培养 一 神经元的原代培养(Primary culture)一、组织来源：1）种属：大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等 2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织 神经胶质细胞：生后早期 大部分神经元：胚胎末期 颗粒细胞：生后两周以内 主要根据轴突和树突
7、广泛分枝发育之前培养 二、常用试剂 1）培养液 A DMEM：B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 E Neurobasal 培养液 2）D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）3)聚L-赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min 4)神经营养因子：睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF):支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF):支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞；
8、硷性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)等 三、培养操作过程 新生13d 大鼠或者胚胎18-19d大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中 剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。消化约20min，用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min，吸收细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
9、用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成一定浓度细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置0.8 0.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37培养。四、神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolose NSE）、微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2）神经元,五、神经元的纯化：1.胞嘧啶阿拉伯糖，培养2d 后用含510 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour,然后改用常规培养液。2.特殊培养液：neurobasal 培养基 培养过程中注意事项 1）培养底物的处理：多聚
10、赖氨酸和多聚鸟氨酸、PEI 细胞外基质成分（胶原）细胞黏附分子 单层非神经细胞 单层的胶质细胞 2）胰蛋白酶的作用时间：3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液 六、神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。接种一般在2-6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长出 24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主 培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起，培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。MAP-2 A B
11、 NSE stain neuron TH stain neuron Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus Slice culture.Lucifer yellow stain(bar 50 m)N 运动神经元 Dil标记 Purkinje cell in culture(PEP-19)二、胶质细胞的培养 胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞 星形胶质细胞 原浆性 少突胶质细胞 b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞 根据免疫组化反应分类：型星型胶质细胞和型星型胶质细胞：标志物
12、 检测对象 型 细胞类型 型 少突胶质细胞 形态 多角型 星型 具有少量突起 A2B5 多聚唾液酸神经节苷脂 +GFAP 胶质纤维酸性蛋白+Ran-2 大鼠神经抗原-2+GC 半乳糖脑苷脂 +GD3 GD3神经节苷脂+3H-GABA GABA摄取+125I-CYP-肾上腺能受体+NG2 300kDa蛋白聚糖 +L1 细胞黏附分子 +Ia 型MHC抗原+研究胶质细胞的方法 1）从未成熟的脑组织分离、培养获得大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学标志物。利用细胞培养可研究胶质细胞的特性 受体的表达：星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传统的神经递质发生反映。（型胶质细胞可表达25种神经配体的
13、受体 神经营养因子的分泌：酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取 髓鞘的形成 神经的局部免疫反应 代谢过程 胶质细胞培养的局限性 1 大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体内相一致的成熟程度，即使成年也可能有干细胞的存在。其形态可能随培养条件而发生变化。2存在不同的细胞亚群 3其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。培养用液 培养基：MEM450ml+血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 青链霉素溶液8ml 葡萄糖-谷氨酰胺 青链霉素溶液（100ml）：葡萄糖 30g；谷氨酰胺 100mmol/l；青霉素 2.5 105U;链霉素 2.510 g 胰蛋白酶：0.25%少突胶质细胞的限定培养液：F12
14、 与DMEM（高糖，4.5 g葡萄糖/L 1：1混合 后加入：BSA：终浓度为0.66 mg/ml,胰岛素:10ng/ml;孕酮:20 nmol/l;腐胺:100 mol/l;碳酸氢钠:3.6 g/l;硒:5ng/ml;T3:30nmol/l;转铁蛋白:50 g/ml.培养的方法：1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒，断头，置于培养皿中 2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮质，去除嗅球等 3 去除脑膜，洗涤（Hanks液）4）组织剪成碎块，37缓慢振荡约10 min。5）胰蛋白酶消化 6)重复吹打，自然沉淀数次，收集细胞悬液（或者6）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单细胞悬液 7）加入完全培
15、养基终止 8）调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养 9）接种3天后换液，以后每两天换液 10）传代,0.25%胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）或着用摇晃的方法 传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分 表面以前，不要急于传代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境 鉴定：星形胶质细胞鉴定：胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein GFAP，A2B5）少突胶质细胞 鉴定：GalC（-galactosidase)神经胶质细胞分离和纯化流程 第
16、0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养 第12天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞 震荡（260rpm，18h）第13天 贴壁的扁平细胞 富含型星型胶质细胞 37培养1h 收获贴壁细胞 富含小胶质细胞 非贴壁的，有突起的细胞，（processing bearing PB）富含型星型胶质细胞 含10%胎牛血清培养 富含少突交质细胞 化学限定培养(oligodendrocyte-2-typeastrocyte,0-2A 其他可选择的分离培养方案 1 低密度接种培养获得型胶质细胞原理：在低密度时神经元和产生型胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞不能存活 优点：简单 缺点：1）仅能获得型胶质细胞 2）成纤维细胞增殖能力更强 3）部分型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获得 3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好 污染细胞的去除污染细胞的去除 1 成纤维细胞的污染：为型星型胶质细胞主要污染细胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别）1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，2）用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸 2 小胶质细胞的污染：1.预
