1、12-去氧佛波醇-13-棕榈酸酯通过 Fas/FasL 通路调控 K562 细胞凋亡马立威1陈哲2李京3张洪涛3贾永明4刘吉成1(齐齐哈尔医学院1 医药科学研究院，黑龙江齐齐哈尔161006;2 公共卫生学院;3 附属第三医院;4 药学院)摘要 目的探讨 12-去氧佛波醇-13-棕榈酸酯(DP)诱导人白血病 K562 细胞凋亡及可能的分子机制。方法Ho-echst33342/PI 染色后，荧光显微镜下观察不同浓度 DP 作用后的 K562 细胞形态学变化;DNA 琼脂糖凝胶电泳法检测 DP 作用后的细胞 DNA“梯带”;分光光度法检测半胱氨酸蛋白酶(caspase)3 酶的活性;实时定量聚合酶
2、链式反应(qT-PC)法检测caspase3、Fas、FasL mNA 表达;Western 印迹检测 procaspase3、Fas、FasL 蛋白表达。结果荧光显微镜下可见:DP 作用的K562 细胞形态学变化明显;DNA 琼脂糖凝胶电泳可见清晰的梯带，随剂量的增加片段化更加明显;与 control 组比较，DP 的作用使 caspase3 酶活明显增加(P0.05，P0.01);DP 的作用使 caspase3、Fas、FasL mNA 表达明显增加(P0.05，P0.01);DP能明显下调 procaspase3 蛋白表达，明显上调 Fas、FasL 蛋白表达(P0.05，P0.01)
3、。结论Fas/FasL 通路参与 DP 诱导 K562细胞凋亡的调控。关键词 12-去氧佛波醇-13-棕榈酸酯;K562 细胞;Fas/FasL 通路;细胞凋亡中图分类号 733.7 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0684-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.045基金项目:齐齐哈尔医学科学院青年博士基金(QMSI2019B-02)通信作者:刘吉成(1958-)，男，博士，教授，主要从事天然药物抗肿瘤分子生物学研究。第一作者:马立威(1987-)，男，博士，助理研究员，主要从事抗肿瘤药物研究。白血病是造血干细胞的恶性克
4、隆性疾病，恶性程度高、进展快、预后差。按起病的缓急可分为急性白血病和慢性白血病两大类。其中，K562 细胞是慢性白血病中的慢性粒细胞性白血病的典型代表细胞，常被用于抗白血病的药物研究。目前西医对白血病的治疗仍以化疗为主要治疗手段。近年来，由于化疗方案的不断完善，使白血病能够得到一定的缓解，但化疗带来许多的不良结果不容忽视，诸如产生耐药、骨髓抑制、白细胞低易感染、血色素低需输血、血小板低出血等1。而中药具有多靶点、多环节、多效应的作用特点，使得从中药中寻找有效的抗肿瘤成分的研究成为热点，也为探讨中药及其有效成分对白血病的治疗研究提供了重要的方向。狼毒大戟为多年生的草本植物，根入药，其味辛，性平，
5、具有逐水祛痰，散结杀虫的功效。中医记载为毒性中药，作为传统中药材，在临床上常被用来治疗肿瘤、癫痫等;民间用狼毒大戟根与大枣蒸食，用于晚期癌症和癌症术后治疗，也用于抗炎、驱虫等。12-去氧佛波醇-13-棕 榈 酸 酯(DP)有 较 好 的 抗 肿 瘤 效果2 5。本研究旨在探讨 DP 体外抗慢性粒细胞性白血病作用。1材料与方法1.1细胞株白血病 K562 细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，本研究室液氮中保存。1.2实验药物及试剂DP 由齐齐哈尔医学院医药科学研究院天然药物化学实验中心提供，4保存，使用时二甲基亚砜(DMSO)调成所需浓度(10 g/L)。PMI1640培 养 基(
6、Hyclone公 司，批 号:AD21582265)，胎 牛 血 清(Hyclone 公 司，批 号:NIJ1221)、双抗(Hyclone 公司，批号:1170005)，Ho-echst33342-碘化丙啶(PI)染色液(南京建成试剂公司，批号:20160712)，DNA 梯带抽提试剂盒(TaKaa公司，批号:AK1301)，半胱氨酸蛋白酶(caspase)3活性检测试剂盒(碧云天试剂公司，批号:c1116)，PrimeScriptT reagent Kit、SYB PremixEx Tap、Trizol(TaKaa 公 司，批 号 分 别 为:AK6002、AK8802、AI51028A)
7、、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(康为试剂公司，批号:00071407)，发光试剂盒(Thermo 公司，批号:PA194447A)，Anti-Fas、Anti-FasL(Abcam 公司，批号分别为:82419、15285)，Anti-caspase3、Anti-GAPDH、Anti-rabbit lgG HP-linked(CST 公司，批号分别为:#12、#06、#20)。1.3主要仪器Observer A1 型荧光显微镜(德国Zeiss 公司)，3111 型细胞培养箱(美国 Thermo 公司)，Safire2 型酶标仪(奥地利 TECAN 公司)，IX51型倒置显微镜(日本
8、OLYMPUS 公司)，7300 型实时定量 C 仪(美国 ABI 公司)，ChemiDoc MP 型全自486中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷动荧光及化学发光系统(美国 BIO-ad 公司)。1.4细胞培养K562 细胞复苏后，接种于细胞培养皿中，用含双抗(青-链霉素)及 10%胎牛血清的PMI1640 培养基培养;置于细胞培养箱(37，5%CO2)中培养，1 2 d 传代 1 次。实验剩余细胞液氮中冻存备用。1.5Hoechst33342/PI 染色检测细胞形态学变化待测细胞样的准备:取生长状态良好的 K562 细胞，细胞计数调整浓度每 2105/ml，接种于 6 孔板中，
9、每孔 2 ml，同时按 DP 浓度分对照(control)组、DP5 g/ml 组、DP 10 g/ml 组、DP 20 g/ml 组共4 组，并对应加入各孔中。按试剂说明书操作:收集药物作用12 h 的各组细胞于4 ml 离心管中，分别加入 Hoechst33342 避光染色 10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2 次，加入 PI 避光染色5 min，PBS 洗2 次，后将各组染色细胞分别滴到载玻片上并盖上盖玻片，荧光显微镜下观察拍照。1.6DNA 琼脂糖凝胶电泳检测分析待测细胞准备同 1.5。取出 DP 作用 16 h 的各组细胞于 EP 管中，离心弃上清加入 PBS 重悬细胞，按照 D
10、NA 提取试剂盒说明书操作，分别加入 NaseA、蛋白酶 K、裂解液混匀后放入 70水浴中 10 min;后加入无水乙醇混匀，可见白色絮状沉淀，将带沉淀的液体全部移到 DNA 纯化柱内;经 2 次离心，洗涤液洗涤后，将DNA 纯化柱置于 1.5 ml 的 EP 管上，加入适量洗脱液，室温放置10 min，离心收集到液体即为纯化的总DNA。将得到的各组 DNA 液加至预先制备的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后取出凝胶，在凝胶成像系统下检测、拍照。1.7分光光度法检测 caspase3 的相对活性待测细胞准备同 1.5。取出 DP 作用 12 h 的各组细胞计数(2.0106)后收集到 EP 管中，加
11、 PBS 重悬细胞，离心弃上清。按试剂盒说明书，各组细胞中加100 l裂解液，冰浴裂解 15 min。4，13 000 r/min离心 15 min，收集上清。按总体积 100 l 设置反应体系:空白组(检测缓冲液 90 l+Ac-DEVD-pNA10 l)，样品组(检测缓冲液 80 l+待测样10 l+Ac-DEVD-pNA 10 l)，并加至 96 孔酶标板中，在酶标仪 405 nm 处测定吸光度值(OD)，同时根据试剂盒提供的标准品(pNA)制备标准曲线，根据标准曲线对应计算各样品的 pNA 值，以 pNA 浓度反映caspase3 酶的相对活性。1.8qT-PC 检测相关基因的表达待测
12、细胞准备同 1.5。取出 DP 作用 12 h 的各组细胞于 1.5 ml的 EP 管中，离心弃上清，每管中加 1 ml Trizon，提取细胞总 NA，测定 NA 浓度及纯度;按照试剂说明书操作:通过逆转录合成 cDNA 后，进行 PC，以-actin 正 义 链:5-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3，反义链:5-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3作为内参基因，待测基因为 caspase3 正义链:5-AGCAATA-AATGAATGGGCTGAG-3，反义链 5-GTATGGAGAAATGGGCTGTAGG-3、Fas 正义链:5-GCATCTGGAC-CCTCCTA
13、CCT-3，反 义 链 5-TCCTCAATTCCAATC-CCTTG-3、FasL 正义链:5-GCACACAGCATCATCTTTGG-3，反义链 5-GGACCTTGAGTTGGACTTGC-3得到各组样本的 Ct 值，并采用相对定量法，按下列公式，计算基因的相对表达量;基因的相对表达量=2Ct注:Ct=(Ct 目的基因Ct对照基因)(Ct内参目的基因Ct 内参对照基因。1.9Western 印迹检测相关蛋白表达取生长状态良好的 K562 细胞，调整细胞浓度为 4.0105/ml，每个培养皿(100 mm)加 8.0 ml，同时加入不同浓度的DP(control 组、5 g/ml 组、1
14、0 g/ml 组、20 g/ml组);培养箱中继续孵育 12 h 后收集细胞于 4 ml 的EP 管中，PBS 洗涤 2 次离心弃上清，每个管里加1.0 ml的含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，提取细胞总蛋白后，按照二喹啉甲 酸(BCA)试剂盒说明书操作，计算各样品的蛋白浓度。提取的蛋白经 100 水浴变性后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分离，后经过转膜、封闭、一抗GAPDH、caspase3 以无活性的前体(procaspase)3、Fas、FasL 反应、二抗反应后进行曝光、获取图片。1.10数据统计采用 SPSS17.0 软件进行 Dunnett 检验、方差分析。2结果2.1Ho
15、echst33342-PI 染色荧光显微镜下观察可见，正常培养的 K562 细胞，细胞增殖较旺盛，镜下细胞呈弱的蓝色银光，可见部分细胞重叠生长;随着DP 浓度的增加，细胞数目逐渐减少，细胞蓝色亮染数目增多;同时被 PI 染色的细胞数量也增多，红色荧光强度逐渐增强;细胞可见核碎裂、核解体等现象，见图 1。2.2DNA 琼脂糖凝胶电泳control 组电泳图显示为一条区带，DP 作用的各组细胞电泳均呈现“梯形”条带，且随 DP 浓度的增大“梯形”条带变得更加明显，见图 2。586马立威等12-去氧佛波醇-13-棕榈酸酯通过 Fas/FasL 通路调控 K562 细胞凋亡第 3 期图 1DP 作用的
16、 K562 细胞荧光显微镜下观察 Hoechst33342-PI 染色后细胞形态学变化(100)图 2DP 作用的 K562 细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳2.3分光光度法检测 caspase3 酶活性结果随着DP 浓度逐渐增大 pNA 浓度逐渐增加，即 caspase3酶相对活性逐渐增加，与 control 组比较差异有统计学意义(P0.05，P0.01)，见表 1。2.4qT-PC 检测相关基因表达与 control 组比较，DP 作用 12 h 的 K562 细胞，根据所得 Ct 值计算:随着 DP 的剂量增加 caspase3、Fas、FasL mNA表达水平均逐渐增高，差异有统计学意义(P0.05，P0.01)，见表 1。2.5Western 印迹检测各组 procaspase3 蛋白表达量，随 DP 剂量的增大逐渐降低，Fas 和 FasL 蛋白表达量随 DP 剂量的增大逐渐增加，与 control 组比较差异有统计学意义(P0.05，P0.01)。见表2、图4。表 1DP 作用的 K562 细胞 caspase3 酶相对活性值与 DP 浓度的关系、caspase3、Fas、
