1、西 北 农 业 学 报 ，（）：株促紫花苜蓿生长的芽孢杆菌分子鉴定及其生物活性分析收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）；青海省科技厅项目（）；青海大学三江源生态与高原农牧业国家重点实验室自主课题（）。第一作者：陈兰，女，硕士研究生，研究方向为环境资源微生物。：通信作者：谢永丽，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为环境资源微生物。：陈兰，谢永丽，吴晓晖，杨雪，王添，武玲玲（青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 ；青海大学 农牧学院，西宁 ）摘要通过菌悬液（浓度为 ）灌根试验，测定分离自青海乌兰荒漠沙地白刺（）根际的株芽孢杆菌（）菌株 、和 对紫花苜蓿（）的促
2、生效果。采用平板对峙法、透明圈法、法分别检测菌株拮抗、固氮及降解纤维素活性，对菌株耐盐及低温适生性进行测定，利用 及 基因序列对菌株进行分子鉴定。结果表明，株菌株对紫花苜蓿幼苗生长均具有显著促生效果。菌株 对禾谷镰孢（）、锐顶镰孢（）、链格孢（）、黑曲霉（）具有显著拮抗效果（抑菌圈直径）。株菌株在改良阿须贝无氮固体培养基上均产生透明圈（透明圈直径），表现出一定的固氮能力。株菌株均具有显著降解纤维素活性。菌株 、和 可耐受 的盐浓度、低温，表现出一定的耐盐性及耐低温性。菌株 、和 分别鉴定为短小芽孢杆菌（）、贝莱斯芽孢杆菌（）、蜡样芽孢杆菌（）及萎缩芽孢杆菌（）。这株优良芽孢杆菌菌株在高原植被恢
3、复、畜牧业发展中具有一定的应用潜力。关键词促紫花苜蓿生长；芽孢杆菌；拮抗；固氮；降解纤维素；分子鉴定农牧业是青海省重要的支柱产业，然而高海拔地区牧草生长期短，产草量低，加上鼠害、过度放牧等因素影响，加剧了高寒草地植被退化、畜牧业发展不平衡现象。紫花苜蓿（）是多年生豆科植物，其茎叶中含有多种营养物质，作为牧草饲料或直接用于青饲、干草都可为畜禽的生长发育提供营养，同时，利用人工种植紫花苜蓿可以提高退化植被恢复率、防止水土流失，改良盐碱地等。作为青海省的优良栽培牧草，紫花苜蓿具有一定的经济价值和生态价值，然而青藏高原海拔高、气温低、干旱等极端生境造成紫花苜蓿的正常生长发育受到限制，导致植株死亡率 大
4、 幅 增 加。陈 华 等从 枯 草 芽 孢 杆 菌（）菌株 中分离出抗生素，研究发现其可对灰霉病菌（）产生拮抗作用，从而提高植物抗病性；黄秋斌等研究发现蜡样芽孢杆菌（）菌株 能够定殖在小麦（）根 系，降 低 小 麦 纹 枯 病（）的侵染，并可提高小麦生物量。因此，利用有益微生物与优良牧草互作，对于提高牧草抗病性、促进牧草生长，增强牧草对盐碱、低温、干旱等特殊生境的抗性，改善贫瘠土壤的理化性以及提高牧草养份的释放效率均具有重要意义。青藏高原特殊生境孕育着特殊适生性微生物资源。芽孢杆菌是一类广泛存在于土壤中的植物根际促生菌，应对不利条件会产生具有特殊抗性的内生孢子，因此，在农业、畜牧业的价值和应用
5、极为重要。芽孢杆菌属分为多个亚群，其中绝大多数菌株都具有特殊生防功能，能够产生次级代谢产物脂肽化合物（），对病原菌正常生长产生干扰或直接破坏其生存环境，抑制病原菌进一步扩展，从而间接促进植物生长，通过生物固氮的方式为土壤提供有机氮，不仅促进土壤营养元素循环、改善土壤肥力，还可定殖在植物根系提供氮元素，促进植物吸收利用。王继雯等 研究发现对小麦施用固氮芽孢杆菌菌株 菌剂会明显促进其主根的生长，同时可提高土壤养分含量。因此，利用具有良好生防功能的本土芽孢杆菌，对于防治植物病害、提高作物生物量及优化贫瘠土壤具有重要意义。此外，芽孢杆菌可产生胞外纤维素酶等能够有效降解植物木质纤维素，将此类生防芽孢杆菌
6、应用于饲草料加工、秸秆降解中，不仅能减轻青海高原秋冬季节家畜饲草料供应不足的问题，还能改良土壤肥力。因此，筛选利用能降解纤维素的芽孢杆菌菌源，是提高秸秆还田效率、促进畜牧业可持续发展的重要措施。本研究以分离自青海乌兰荒漠沙地白刺（）根际的株芽孢杆菌菌株为供试菌，以菌悬液（浓度为 ）对紫花苜蓿灌根测定其对牧草促生效果，测定菌株拮抗种病原真菌活性、固氮能力、降解纤维素活性及耐盐、低温适生性，对菌株进行 及 分子鉴定，以期筛选出对高原特殊环境有强适应性和适生性的拮抗芽孢杆菌，为促进紫花苜蓿生长、退化植被恢复、饲草料加工等提供优质菌源。材料与方法 材 料芽 孢 杆 菌：菌 株 、分离自青海乌兰荒漠地白
7、刺（）根围。病原真菌：禾谷镰孢（）分离自小麦（）、锐顶镰孢菌（）分 离 自 梭 罗 草（）、链格孢（）分离自老鹳草（）、黑曲霉（）分离自高山嵩草（）。培养基及试剂：培养基；低温 培养基；培养基；改良阿须贝（）无氮固体培养基；培养基。仪器：恒温振荡培养箱；离心机；智能人工气候箱。草种：紫花苜蓿（）种子由青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室提供。方 法 芽孢杆菌促紫花苜蓿生长测定芽孢杆菌菌悬液制备：在、条件下，将菌株 、和 在 液体中活化 ，倒 入 离 心 管，、离心 ，弃上清，无菌水洗菌体次，加入适量无菌水、涡旋次制成悬浮液，以 液体为对照，测定 的吸光度值，将浓度调成 （），备用。芽孢
8、杆菌促紫花苜蓿生长：用（体积比）的 溶液浸泡紫花苜蓿种子 ，无菌水冲 洗 次，加 入 （体 积 比）的消毒 ，用无菌水冲洗干净；天然土与蛭石按质量比（）比例混匀后灭菌；随机选取 粒处理后的紫花苜蓿种子播入穴盆中，置于智能人工气候箱中培养（，光周期 光照黑暗）。待幼苗株高达到，用 菌悬液对植株进行灌根处理，对照组用同体积的无菌水处理；继续培养后，取出紫花苜蓿幼苗，保持植株干净完好，测量其株高、根长，吸干根表水分后测定鲜质量。芽孢杆菌拮抗活性测定打取直径为禾 谷 镰 孢（）、锐 顶 镰 孢（）、链格孢（）、黑曲霉（）的菌饼，分别接种在新的 平板中央，置于 培养；以菌饼为中心的个对称点作为接种点，各
9、放置一个直径的滤纸小圆片。分别挑取菌株 、和 的单菌落置于含有 液体培养基的试管中，在 ，活化，吸取菌液接在滤纸片中央，继续培养后，取出观测并记录抑菌数据。芽孢杆菌固氮能力测定将菌株 、和 单菌落接种至 液体培养基中摇培，作为菌悬液。在 无氮固体培养基中央放置一个直径为 的滤纸小圆片；吸取菌悬液分别接种于滤纸片，在 条件下培养。观察并测量菌落的生长，根据 所 形 成 的 透 明 圈 大 小，检 测 其 固 氮 能力。芽孢杆菌降解纤维素活性测定在培养基中央放置一个直径的滤纸小圆片，分别吸取 摇培后的 、和 菌悬液点接在滤纸片中央，置于 恒温箱内培养后，取出后注入 碘染液，静置 ，倒去染液。测量并
10、记录透明圈及菌落直径，确定比值 。芽孢杆菌耐逆性测定耐盐性测定：配制期陈兰等：株促紫花苜蓿生长的芽孢杆菌分子鉴定及其生物活性分析梯度 的质量浓度为 、的 液体培养基，挑取株菌株单菌落分别接种到不同浓度梯度的 液体培养基中，活化；将 菌液涂布于对应盐浓度的固体 平板，倒置于 恒温箱内培养。每天观察并记录菌株生长和扩展，测定菌株的耐盐性。耐低温测定：将株菌株单菌落分别接种到含有低温 液体培养基的试管中，活化；取菌液接种在 固体培养基上，以温度梯度、下培养。每天观察并记录生长情况，测定菌株的耐低温性。芽孢杆菌分子鉴定 序列鉴定：菌株 、和 的基因组 提取参照张瑞福等 方法进行，利用正向 引 物 （）
11、，反 向 引 物 （），引物序列及供试菌的基因组 由上海美吉生物公司进行合成并测序。将所 获 得 的 拼 接 序 列 在 数 据 库（：）进行在 线 比 对，以 （，）软件构建系统发育树。基因序列鉴定：利用正向引物 （），反 向 引 物 （）；引物序列及供试菌的基因组 由上海美吉生物公司进行合成并测序。序列比对与系统发育树分析同上述方法。结果与分析 芽孢杆菌促紫花苜蓿生长效应菌悬液对紫花苜蓿幼苗灌根处理后培养，紫花苜蓿幼苗生物量的测量结果表明，株菌株对紫花苜蓿幼苗生长均具有促进作用。其中，菌株 对紫花苜蓿幼苗生长的促进作用最为显著（），处理组的紫花苜蓿幼苗平均株高、根长、鲜质量分别达到 、，与
12、 对 照 组 相 比 分 别 增 加 、（图和表）。株菌株对紫花苜蓿幼苗的地上、地下部分及鲜质量均具有促进作用，可积累植物生物量。对照；菌株 促紫花苜蓿生长；菌株 促紫花苜蓿生长；菌株 促紫花苜蓿生长；菌株 促紫花苜蓿生长 ；图株芽孢杆菌菌株促紫花苜蓿生长效应 芽孢杆菌拮抗病原真菌活性拮 抗 病 原 真 菌 活 性 测 定 结 果 表 明，菌 株 、和 对禾谷镰孢、锐顶镰孢、链格孢和黑曲霉均具有一定的拮抗活性。其中菌株 对种病原真菌的抑菌圈直径均在 以上，较大程度抑制病原菌的生长和扩散，表现出显著拮抗活性。株芽孢杆菌菌株对分离自不同植物的种病原真菌均具有拮抗作用（图和表）。西北农业学报 卷表株
13、芽孢杆菌菌株促紫花苜蓿幼苗生长效率（?）菌株 地上 株高 促生效果 地下 根长 促生效果 鲜质量 促生效果 注：同列不同字母表示在 水平上存在显著差异（）。：（）拮抗禾谷镰孢；拮抗锐顶镰孢；拮抗链格孢；拮抗黑曲霉 ；图株芽孢杆菌菌株拮抗种病原真菌活性 表株芽孢杆菌菌株对病原真菌的拮抗活性（?）菌株 禾谷镰孢 直径 抑菌活性 锐顶镰孢菌 直径 抑菌活性 链格孢 直径 抑菌活性 黑曲霉 直径 抑菌活性 注：直径指抑菌圈直径；“”，指抑菌圈直径为；“”，指抑菌圈直径为 ；“”，指抑菌圈直径为 ；“”，指抑菌圈直径。：；“”；“”；“”；“”芽孢杆菌固氮能力固 氮 能 力 测 定 结 果 表 明，菌
14、株 、和 均 具 有 良 好 的 固 氮 能力。将株菌株接种于改良 无氮固体培养基平板上培养后发现其均能产生透明圈，形成的透明圈直径分别为、，表明 株 菌 株 均 可 在 无 氮 培 养 基 中 正 常 生 长（图）。芽孢杆菌降解纤维素活性降解纤维素活性测定结果表明，菌株 、和 均能够降解纤维素。将株菌株接种在 培养基平板中央进行培期陈兰等：株促紫花苜蓿生长的芽孢杆菌分子鉴定及其生物活性分析养，使用 染色后，均产生明显的透明圈，其直径分别为、，说明芽孢杆菌产生纤维素酶将 水解产生还原糖，使其无法附着染料而形成透明圈。其中，菌株 的降解纤维素活性最为明显，其 值为 （图和表）。菌株 形成的透明圈
15、；菌株 形成的透明圈；菌株 形成的透明圈；菌株 形成的透明圈 ；图株芽孢杆菌菌株在改良 无氮固体培养基上形成的透明圈 菌株 形成的透明圈；菌株 形成的透明圈；菌株 形成的透明圈；菌株 形成的透明圈 ；图株芽孢杆菌菌株在 培养基上形成的透明圈 表株芽孢杆菌菌株降解纤维素活性 菌株 透明圈直径（）菌落直径（）值（）芽孢杆菌的耐逆性 耐盐性耐盐性测定结果表明，菌株 只能在盐浓度为 、的培养基上生长，其余株菌株在盐浓度为 培养基上均可正常生长，表现出良好的耐盐性。其中，菌株 在盐浓度为 的 固体培养基上可缓慢生长，表现出显著的耐盐特性（表）。耐低温性低温适生测定结果表明，菌株 、和 培 养 在 、条件
16、下，后均长出菌圈；低温时，菌株 和 生长和扩展较快，培养后即出现明显的菌苔，菌株 和 培养第天 长 出菌苔；时，菌株 、和 均可缓慢生长，培养第天后出现少量菌苔，其 余 株 菌 株 不 能 生 长。由 此 可 见，菌 株 、和 具有良好的低温适生性（表）。芽孢杆菌的分子鉴定 序列鉴定序列与 中 已 知 序 列 比 对 结 果 表 明，菌 株 与 （登录号：）的 序 列 一 致 性 为 ，菌 株 与 （登录号：）的 序列一致性为，菌株 与 （登录号：）的 西北农业学报 卷序列一致性为，菌株 与 （登录号：）的 序列一致性为（表）。构建的 基因序列系统发育树表明株供试菌株与已知菌株具有明显的亲缘关系（图）。表株芽孢杆菌菌株的耐盐性及低温适生性 菌株 耐盐性 菌株 低温适生性 注：“”生长良好；“”正常生长；“”缓慢生长；“”不能生长。：“”；“”；“”；“”基因序列鉴定序列与 中 已 知 序 列 比 对 结 果 表 明，菌 株 与 （登 录 号：）的 基因序列一致性为 ，菌株 与 （登录号：）的 基因序列序列一致性为，菌株 与 （登录号：）的 基因序列一致性为 ，菌株 与 （登录号：）的
