1、作者简介：徐阳，男，技师，主要从事临床检验的相关研究。通信作者，：。论著 在三阴性乳腺癌中的临床意义及其与 调控的关系徐阳，潘胜男南京医科大学附属淮安第一医院医学检验中心，江苏淮安 摘要：目的探讨长链非编码 （）癌易感候选基因（）对三阴性乳腺癌（）细胞株 迁移和侵袭能力的影响及其调控机制。方法采用实时荧光定量 （）检测 组织芯片中 和 的表达；分析 组织中 的相对表达水平与患者临床病理参数及预后的相关性；通过 实验验证 与 对 细胞株 迁移和侵袭能力的影响；采用双荧光素酶报告实验对 与 之间的调控关系进行验证。结果 在 组织中的表达水平异常升高（），而 在 组织中的表达水平下调（）；肿瘤组织中
2、 的表达水平与脉管浸润、阳性淋巴结数目、淋巴结转移、远处转移、分期以及复发情况有关（），并且在期、期以及期 患者中，高表达的 患者总体生存时间和无复发生存时间较 低表达的 患者明显缩短（），的相对表达水平是 患者预后较差的独立危险因素；实验表明下调 能够逆转 沉默介导的对 细胞迁移和侵袭的抑制作用，双荧光素酶报告实验表明 能够调控 。结论 的异常高表达与 的发生、发展以及不良预后密切相关，其能够通过调控 诱导 细胞的迁移和侵袭。关键词：三阴性乳腺癌；长链非编码；癌易感候选基因；迁移；侵袭 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，：（）（）（）（）；，（），（）；，（），（），国际检验医学杂
3、志 年月第 卷第期 ，：；三阴性乳腺癌（）指的是免疫组织化学染色报告中，雌激素受体（）、孕激素受体（）及人表皮生长因子受体（）均为阴性的乳腺癌亚型，约占新诊断乳腺癌数量的，是目前乳腺癌治疗中最棘手的一类，病死率高且最容易转移和复发，虽然诊断和治疗的手段有了长足的发展，但是 患者的生存率仍然不容乐观，肿瘤转移极大地降低了治疗的成功率，是肿瘤相关性死亡首要的因素，因此，全面了解 发生、发展的机制对于改善患者的预后意义重大。长链非编码 （）是长度超过 个核苷酸且缺乏蛋白质编码功能的转录本，参与多种生理和病理过程，尤其是肿瘤领域。此外，越来越多的证据表明 能够通过竞争性内源（）机制吸附微小（）调控下游
4、基因表达和生物学功能，例如 通过 促 进 乳 腺 癌 的 进 展，通过吸附 促进肺癌细胞铁死亡。本研究 拟探讨 癌 易 感 候 选 基 因（）对 细胞株 迁移和侵袭能力的影响及其调控机制，以期为 的转移机制研究提供新的见解。也有望成为 新的治疗靶点和预后标志物。材料与方法材料与试剂实验中所使用的 例 组织和配对癌旁组织的 芯片购自上海芯超生物科技有限公司，公司与合作医院签订了合作协议，标本收集获得合作医院的伦理委员会批准并经过被研究对象及其家属同意，产品编码 ，患者临床及病理资料包括年龄、性别、脉管浸润、阳性淋巴结数目、淋巴结转移、远处转移、分期以及随访资料等信息，所有患者术前均未接受任何治疗
5、，包括放射治疗、化学治疗及靶向治疗等治疗。手术时间从 年月至 年月，随访截至 年月，死亡 例，完整资料可以在网站（：）上查询。胎牛血清（）和 培养基购自美国 公司，试剂和 购自美国 公司，实时荧光定量 （）检测试剂盒购自日本 公司，小室购自美国康宁公司，小 干 扰 片 段（）、类 似 物（）抑制剂（）、野生型和突变型双荧光素酶报告载体均由上海吉泰生物有限公司构建合成，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国 公司，所有引物购自上海生物工程有限公司。使用 （：）以及 （：）生物信息学数据库验证 与 是否存在物理学上的结合位点。方法细胞培养人正常乳腺上皮细胞株（）以及 个 细胞系（、和 ）购自中国科学
6、院上海细胞库，将细胞培养使用含 的培养基中，放置于、的孵育箱中培养，待细胞生长至 密度后进行传代，选择对数生长期的细胞进行实验。细胞转染和双荧光素酶报告实验取对数生长期的 细胞制备成单细胞悬液，均匀的接种在六孔板中，于、的孵育箱中孵育，当细胞密度达到约 ，根据试剂盒说明书进行转染。配制液：将干扰片段或阴性对照加入到 的低血清培养基中，轻柔混匀静置 ；液：将 加入到 的低血清培养基中，轻柔混匀静置 ，将液和液混匀并静置 ，缓慢加入到相应六孔板中，继续置于 、的培养箱中培养。构建含有 结合位点的野生型和突变型 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体。突变型质粒突变的部分是与 结合的 位 点（数 据 库
7、 预 测）。使 用 将双荧光素酶报告载体或阴性对照与 共转染至 细胞中，后测定各组荧光素酶活性。检测 和 的表达水平使用 试剂提取 细胞系和人正常乳腺上皮细胞株中总 ，根据反转录试剂盒提供说明书进行反转录，分别以 和 为内参，参照荧光定量 试剂盒说明书使用荧光定量 仪对 和 的表达水平进行 检测，采用公式 计算 和 的相对表达水平，本研究所使用的引物序列见表。检测 的反应条件：预变性，变性，退火 ，延伸，共 个循环。实验检测细胞迁移和侵袭能力用胰蛋白酶消化并收集对数生长期细胞，用无血清培养基将每组细胞调整为 的悬液，取 细胞悬液加入到上层小室中（侵袭实验在此基础上小室底部加入配套的基质胶），在
8、下层小室中加入 含 的 培养基，于、国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，培养箱中孵育，用棉签擦去小室上层未穿过膜的细胞，将小室放置于多聚甲醛中 ，取出晾干后进行结晶紫染色，用倒置显微镜随机挑选个高倍镜视野计算穿膜细胞数并拍照。表所用引物序列检测指标正向引物（）反向引物（）统计学处理本研究采用 和 软件进行统计学分析，统计学方法包括检验、方差分析、相关、检验、精确检验、似然比检验、回归分析及 分析等。为差异有统计学意义，所有实验均重复至少次。结果 在 中的相对表达水平及其与 患者临床病理参数间的相关性 结果显示，与癌旁组织相比，在 组织中的相对表达水平异常升高，而 则表达下调，见表，差异有统计学
9、意义（）。通过对种 细胞（、和 ）以及人正常乳腺上皮细胞 中 的相对表达水平进行检测，结果发现种 细胞中 的相对表达水平均高于人正常乳腺上皮细胞 ，差异均有统计学意义（），见图。此外，通过分析 的表达水平与患者临床病理间参数间的关系，结果发现，组织中 的相对表达水平与 患者脉管浸润、阳性淋巴结数目、淋巴结转移、远处转移、分期以及复发情况有关，相对表达水平越高，患者有较多的肿瘤细胞脉管浸润，有较多的淋巴结及远处转移，分期更高，更易复发（），此外，相对表达水平与患者年龄、分期无关（），见表。表 组织和癌旁组织中 及 相对表达水平检测指标分组相对表达水平差值差值的 配对检验 组织 癌旁组织 组织 癌
10、旁组织 表 组织中 相对表达水平与患者临床病理参数间的相关性（）临床病理参数 低表达高表达 年龄（岁）（）（）（）（）脉管浸润 无 （）（）有 （）（）阳性淋巴结数目 （）（）（）（）（）（）分期 （）（）（）（）（）（）续表 组织中 相对表达水平与患者临床病理参数间的相关性（）临床病理参数 低表达高表达 淋巴结转移 无转移 （）（）有转移 （）（）远处转移 无转移 （）（）有转移（）（）分期 期 （）（）期 （）（）复发情况 无复发 （）（）有复发 （）（）注：代表 似 然 比 检 验；代 表 精 确 检 验；表 示 此 项 无数据。与 患者的总体生存时国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，间
11、及无复发生存时间的相关性分析通过生存分析发现，在 期（例）、期（例）、期（例）的 患者中，高 表 达 患 者 的 总 体 生 存 时 间 较 低表达的患者明显缩短，差异有统计学意义（分别为 、，），高表达患者的无复发生存时间较 低表达患者明显缩短，差异有统计学意义（分 别 为 、，）。而 在 期（例）中，高表达 患 者 总 体 生 存 率 和 无 复 发 生 存 率 与 低表达患者比较差异无统计学意义（分别为 和 ，），见图。多因素 回归分析结果显示，组织中 的表达水平是 患者预后较差的独立危险因素（）。见表。对 细胞迁移和侵袭能力的影响通过在 细胞株中转染种 用于敲减 的表达，检 测 结 果
12、 发 现，转 染 后 的下调效果最明显（），见图，因此本实验选择 进行体外细胞功能实验。通过 实验验证发现，与空白对照组和阴性对照组相比，敲减 后 细胞的迁移和侵袭能力明显收到抑制（），见图。注：与 细胞比较，表示差异无统计学意义。图 在 细胞株和正常细胞株中的表达水平注：和分别为 期（例）总体生存曲线和无复发生存曲线；和分别为 期（例）总体生存曲线和无复发生存曲线；和分别为 期（例）总体生存曲线和无复发生存曲线，和分别为 期（例）总体生存曲线和无复发生存曲线；期例数太少，无法单独分析；表示 ，表示差异无统计学意义（）。图 表达情况与 患者的总体生存时间和无复发生存时间相关性分析表 患者预后影
13、响因素的 回归分析因素单因素分析 多因素分析 年龄 脉管浸润 阳性淋巴结数目 分期 淋巴结转移 远处转移 分期 复发情况 表达水平 注：表示此项无数据。下调 能够逆转 沉默介导的 细胞迁移和侵袭的抑制 国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，实验结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，转染 能够抑制 细胞的迁移和侵袭能力。联合转染 和 后发现，与单独转染 相比，联合转染组 细胞的迁移和侵袭能力增强。结果表 明，下 调 能 够 逆 转 敲 减 介导的 细胞迁移和侵袭的抑制作用，见图。注：表示 的筛选；表示转染 能够抑制 细胞的迁移和侵袭能力；表示对照干扰片段；与转染 的细胞比较，。图下调 对 细胞迁
14、移和侵袭能力的影响注：表示对照干扰片段；与 比较，。图转染 以及联合转染 和 对 细胞迁移和侵袭能力的影响国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，在 细 胞 中 可 能 调 控 表达通过使用人类 靶标预测工具 并结合 数据库，预测 可能是 的靶标，见图。转染 干扰片段后，表达水平明显升高，见图。此外，使用双荧光素酶报告实验进一步验证 和 之间的是否存在物理学结合位点，通过构建与 具有结合位点的 野生型和突变型双荧光 素 酶 报 告 质 粒，见 图 。“与 结合验证”结果发现，与阴性对照组相比，共转染 后能够抑制 野生型表达载体的荧光素酶活性，但 突变型表达载体的荧光素酶活性没有变化，见图。注：为通
15、过生物信息学数据库对 和 的物理学结合位点进行预测；为敲减 后 的表达水平变化；为共转染 和 野生型或突变型双荧光素酶报告质粒后荧光素酶活性变化；为 野生型和突变型双荧光素酶报告质粒的构建；与 比较，；为野生型；为突变型。图 在 细胞中作为内源竞争 （）调控 表达讨论如 今，占 所 有 乳 腺 癌 的 比 例 为 ，与其他乳腺癌分子亚型相比，更易复发转移，并且在明确诊断后总体生存率处于较低的水平。因此，阐明 发生、发展的分子机制并寻找潜在的治疗靶点显得尤为重要。越来越多的研究表明，在肿瘤发生发展的过程中发挥着至关重要的作用，研究报道，在前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、肺癌、神经母细胞瘤等肿瘤中异
16、常升高，通过内源竞争 （）机制促进肿瘤的恶性生物学行为 ，本研究发现，在 组织和细胞中的表达异常升高，表明 可能参与了 的发生。此外，的表达与 脉管浸润、阳性淋巴结数、淋巴结转移、远处转移呈正相关，表明 促进 侵袭及转移，肿瘤发生转移往往先浸润基底膜，突破基底膜后通过脉管或者淋巴结转移到周围或远处器官，一旦肿瘤细胞发生转移对预后会产生极为不利的影响，体外侵袭和转移实验结果验证了该推断，同样 与患者 分期以及复发密切相关，患者 分期高往往意味着肿瘤进展越快，肿瘤复发意味着以前对肿瘤疗效很好的放射治疗、化学治疗及靶向治疗方案变得没有效果，恶性肿瘤细胞再次生长起来，患者预后往往不良。生存分析结果发现，在 期、期和 期的 患者中，高表达的 患者总体生存率和无复发生存率均低于 低表达患者，此外，多因素回归分析结果表明，的高表达是 患者 预 后 不 良 的 独 立 危 险 因 素，提 示 可能会成为 患者潜在的预后标志物，综合以上证据表明，与 的转移、复发以及不良预后密切相关，在 的发生、发展过程中起到了至关重要的作用。有研究报道 在神经母细胞瘤中表达水平异常下调，并能通过 机制调控肿瘤的发生发展
