1、微生物学实验 海南大学海洋学院 实验一实验一 细菌的形态和结构观察细菌的形态和结构观察 一、实验目的一、实验目的 观察细菌的菌落特征观察细菌的菌落特征 掌握简单染色法和细菌涂片方法掌握简单染色法和细菌涂片方法 在油镜下观察细菌个体的形态特征在油镜下观察细菌个体的形态特征 形态形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等
2、发生变化。成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为形态观察的不同要求，可将染色分为3 3种类型：简单染色、种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。鉴别染
3、色、特殊染色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 二、实验的基本原理二、实验的基本原理 简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、结晶紫等进行染色。结晶紫等进行染色。采用加热或化学固定两种方法采用加热或化学固定两种方法，使菌体粘附于使菌体粘附于玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力 三、三、实验材料实验材料 显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。纸、吸水纸等。0.05%和和0.1%吕氏碱性美
4、蓝染色液，吕氏碱性美蓝染色液，0.5%番番红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水 细菌三种形态的染色标本。细菌三种形态的染色标本。大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳链球菌链球菌24h24h液体培养基培养物液体培养基培养物 盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。简单染色法（一般染色法）简单染色法（一般染色法）.菌种：菌种：牙垢细菌牙垢细菌 .涂片涂片 .干燥：干燥：自然气干或酒精灯自然气干或酒精灯高处微微加热。高处微微加热。固定固定 .染色：染色：在整个涂面上滴加在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复
5、红，染色分齐氏石炭酸复红，染色分钟钟。.水洗：水洗：倾去染液，用自来倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。染料颜色为止。干燥：干燥：空气中自然干燥。空气中自然干燥。镜检：镜检：在油镜下观察牙垢在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。中的各种细菌形态并绘图。四、实验步骤四、实验步骤 四、实验步骤四、实验步骤 油镜的使用油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜
6、下找到清晰的物象后，提升聚光镜，油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。显微镜保
7、养和使用中的注意事项：显微镜保养和使用中的注意事项：1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以
8、免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片镜片。四、实验步骤四、实验步骤 细菌三种基本形态的观察：细菌三种基本形态的观察：菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。个体形态的观察。1.结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球结合油镜的使用，观察三张细菌染
9、色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。2.看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。四、实验步骤四、实验步骤 思思 考考 题题 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？应特别注意些什么？使用油镜时，为什么必须用镜头油？使用油镜时，为什么必须用镜头油？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？而不是直接用高倍镜或油镜观察？实验二实验二 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 一、实验目的一、实验目的 掌握细
10、菌的革兰氏染色掌握细菌的革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造观察和识别细菌细胞的特殊构造 细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色有不同的反应（阳性和阴性）：有不同的反应（阳性和阴性）：革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度低，当以低，当以95%95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变大，肽聚糖因大，肽聚糖因95%95%酒精
11、处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被合物被95%95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成红色；红色；革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经95%95%酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被结晶紫与碘形成的紫色
12、染料复合物很难被95%95%酒精洗脱出细胞壁酒精洗脱出细胞壁之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏(LugolLugol)碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番红染色液。番红染色液。菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌24h
13、24h普通海水琼脂斜面普通海水琼脂斜面2828培培养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌24h24h牛肉膏琼脂斜面牛肉膏琼脂斜面2828培养物。培养物。三、实验材料三、实验材料 革兰氏（革兰氏（Gram）染色法）染色法 1.涂片涂片 2.初染：初染：在做好的涂面上滴加在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染草酸铵结晶紫染液，染1分钟，分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：媒染：先用新配的路哥氏碘先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂液冲去残水，而后用其覆盖涂面面1分钟，后水洗。分钟，后水洗。4.脱色：脱色：除去残水后，滴加除去残水后，
14、滴加95%酒精进行脱色约酒精进行脱色约30秒，后秒，后立即用流水冲洗。立即用流水冲洗。5.复染：复染：滴加番红染色液，染滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：镜检：观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。四、实验步骤四、实验步骤 思思 考考 题题 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？哪些操作？关键在哪几步？为什么？实验三实验三 实验室环境及人体表面的实验室环境及人体表面的 微生物检查微生物检查 认识细菌分布的广泛性；认识细菌分布的广泛性；掌握对菌落识别；掌握对菌落识别；懂得无菌操作的重要
15、性。懂得无菌操作的重要性。一、实验目的一、实验目的 每一菌体在适宜每一菌体在适宜条件下，条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉经过多次细胞分裂可形成一个肉眼可见的子细胞集合体，称为菌落。眼可见的子细胞集合体，称为菌落。由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现其固有的特点。其固有的特点。通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中基上，
16、经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中及人体细菌的数量和类型。及人体细菌的数量和类型。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭子等。子等。琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，2 2碘酒，碘酒，7575乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革兰氏染色剂。兰氏染色剂。水样，泥土，空气和人体。水样，泥土，空气和人体。三、实验材料三、实验材料 1、正常人体的细菌检查 皮肤细菌的检查 （1）将手指在平板上按一下；取一根头发，用无菌镊子贴放在平板上。（2）平板培养、观察 四、实验步骤四、实验步骤 咽部细菌的检查 （1）用无菌棉拭子蘸取咽部分泌的液体，然后将该棉拭子在血琼脂平板一端涂抹，接下来用接种环以涂抹处为起点，在平板上画之字形图案进行分离。（2）将血琼脂平板置37培养箱中，培养1824h，挑选不同菌落作革兰氏染色，镜检。四、实
