1、现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.003ABCA2 基因 mRNA 在结核分枝杆菌不同感染阶段的表达及其作为诊断标志物的研究*刘艳华1王若1苏瑾文2俞珊2孙雯娜1程小星1（1 解放军总医院第八医学中心结核病医学部 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室 北京 100091；2 解放军总医院第八医学中心结核病医学部结核科 北京 100091）摘要 目的：比较 ATP 结合转运蛋白 A2（ATP-binding cassette transpo
2、rterA2，ABCA2）基因 mRNA 在活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染状态下的表达差异及其作为诊断标志物的能力。方法：收集活动性结核病患者、结核分枝杆菌潜伏感染者和健康人外周血，荧光定量 PCR 检测受试者外周血单个核细胞中 ABCA2 的 mRNA 水平，统计学分析各组 ABCA2 基因表达差异，及其鉴别活动性结核和潜伏感染的能力。结果：活动性结核病患者外周血单个核细胞中 ABCA2 的 mRNA 表达显著低于潜伏感染者和健康人（H=83.38，P0.0001）。ABCA2 鉴别诊断活动性结核和潜伏感染的曲线下面积为 0.9235，灵敏度为 73.53%（95%的置信区间为 63.8
3、7%81.78%），特异性为 93.55%（95%的置信区间为 78.58%99.21%）。结论：外周血单个核细胞中 ABCA2 基因 mRNA是鉴别活动性结核病和潜伏感染者的潜在标志物，有助于活动性结核病的辅助诊断。关键词：活动性结核病；潜伏感染；诊断标志物；ATP 结合转运蛋白 A2 基因；mRNA中图分类号：R52文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-211-05The mRNA Expression of ABCA2 Gene from Individuals in DifferentInfection Stages of Mycobacterium Tuberc
4、ulosis and its Potential asa Diagnositic Biomarker*LIU Yan-hua1,WANG Ruo1,SU Jin-wen2,YU Shan2,SUN Wen-na1,CHENG Xiao-xing1(1 Tuberculosis Prevention and Control Key Laboratory/Beijing Key Laboratory of New Techniques of Tuberculosis Diagnosis andTreatment,SeniorDepartmentofTuberculosis,theEighthMed
5、icalCenterofPLAGeneralHospital,Beijing,100091,China;2TuberculosisDepertment,Senior Department of Tuberculosis,the Eighth Medical Center of PLA General Hospital,Beijing,100091,China)ABSTRACT Objective:To investigate the mRNA level of ATP-binding cassette transporterA2(ABCA2)gene from individuals indi
6、fferent infection states of Mycobacterium tuberculosis and its ability as a diagnostic marker.Methods:The peripheral blood frompatients with active tuberculosis,individuals with latent tuberculosis infection and healthy people was collected.The mRNA level ofABCA2 in peripheral blood mononuclear cell
7、s was detected by fluorescence quantitative PCR.The difference of ABCA2 mRNA ingroups and its diagnostic ability to distinguish patients with active tuberculosis from individuals with latent tuberculosis infection wereanalyzed by statistical softwares.Results:The mRNA expression of ABCA2 from patien
8、ts with active tuberculosis was significantlylower than that from individuals with latent infection and healthy people(H=83.38,P0.0001).The area under the curve of ABCA2mRNA in discriminating patients with active tuberculosis from individuals with latent tuberculosis infection was 0.9235,the sensiti
9、vityand specificity were 73.53%(95%confidence interval,63.87%81.78%)and 93.55%(95%confidence interval,78.58%99.21%)respectively.Conclusions:The mRNA of ABCA2 gene in peripheral blood mononuclear cells is a potential marker to distinguish activetuberculosis from latent tuberculosis infection,and is h
10、elpful to tuberculosis diagnosis.Key words:Active tuberculosis;Latent tuberculosis infection;Diagnositic marker;ATP-binding cassette transporterA2;mRNAChinese Library Classification(CLC):R52Document code:AArticle ID:1673-6273（2023）02-211-05*基金项目：国家重大传染病专项课题（2017ZX10201301-007）；国家自然科学基金面上项目（82072233）
11、作者简介：刘艳华（1979-），女，研究生，副研究员，主要研究方向：结核病免疫学研究，电话：010-66775674，E-mail：通讯作者：程小星，男，研究生，研究员，主要研究方向：结核病免疫学研究，E-mail：（收稿日期：2022-04-28 接受日期：2022-05-24）前言结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobac-terium tuberculosis，M.tb）感染引发的慢性传染性疾病，严重威胁人类健康。人类感染 M.tb 后，约 5%10%的感染者会发展为活动性结核病（Active tuberculosis，ATB），绝大多数处于不发病211现代
12、生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023的带菌状态，称为潜伏感染（Latent tuberculosis infection，LTBI）据估计世界有 1/3 的人感染 M.tb，这些无临床症状的潜伏感染者是活动性结核病患者的重要来源。潜伏感染与活动性结核病的鉴别诊断至关重要1。我们前期的转录组测序结果发现活动性结核病患者和健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中 ABCA2 基因 mRNA 的表达存在显著差异（结果部分图 1）。ABCA2 基因编码 ABCA
13、2 蛋白，属于 ABC 转运子家族，表达于神经细胞、巨噬细胞、单核细胞和造血干细胞等多种细胞中，主要作用是保持细胞内脂类成分的内平衡和代谢。ABCA2 也可表达于肿瘤细胞中，有助于肿瘤细胞的增殖。ABCA2 与早期动脉粥样硬化、丹吉尔病、小细胞肺癌、急性白血病和阿尔茨海默病的发病相关，还与癌症化疗的耐药相关2-6。据我们所知，ABCA2 与结核病的相关研究较少。为了进一步研究 ABCA2 在结核病中的表达情况，本研究收集活动性结核病患者、结核潜伏感染者和健康人的外周血，通过荧光定量 PCR（fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法检测 ABCA2 基因转录水平
14、，并分析了该基因 mRNA 鉴别活动性结核病和潜伏感染的能力。1 材料与方法1.1 研究对象本研究纳入了 2018 年 2 月到 7 月期间解放军总医院第八医学中心的结核病住院患者，结核病的诊断依据为 肺结核病诊断7，包括临床表现、CT 检查、抗酸染色（acid fast stain，AFB）、细菌培养和核酸检测等。按 AFB 或细菌培养结果分组，结果为阳性者定为菌阳结核组，结果为阴性者定为菌阴结核组。按结核发病部位分组，肺部发病为肺结核组，其他器官发病为肺外结核组。结核潜伏感染者和健康人为 2018 年 3 月到 6月期间解放军总医院第八医学中心的体检人员，两组受试者均没有结核病史和结核病临
15、床表现，X-ray 检查正常，IGRA 阳性者为结核潜伏感染者8，IGRA 阴性者为健康人。纳入的研究对象均没有肝炎、艾滋病和自身免疫相关疾病。本研究通过解放军总医院第八医学中心伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。1.2 样本采集与处理抽取受试者的外周血并置于肝素抗凝管中，46 小时内用Ficoll 分离液（美国 GE）分离 PBMCs，用 RPMI-1640 培养液（美国 Invitrogen）洗涤细胞 2 遍，沉淀用 1 mL 的 Trizol（美国Invitrogen）溶解并冻于-80 备用。1.3 RNA 提取和 cDNA 合成Trizol 法提取细胞总 RNA。具体操作如下：
16、1 mL 的 Trizol细胞裂解液中加入 0.2 mL 氯仿，涡旋后静置 5 min，4 12000r/min 离心 15 min，取上层无色水相至新离心管中并加入 0.5mL 异丙醇，混匀后室温放置 10 min，4 12000 r/min 离心10 min，弃去上清加入 1 mL 的 75%乙醇，4 10000 r/min 离心 10 min，弃上清，RNA 沉淀在室温中干燥 10 min，加入 40 L无 RNase 的 ddH2O 溶解 RNA，冻于-80 备用。TaKaRa 反转录试剂盒（大连宝生物）用于 cDNA 的合成，具体操作参照产品说明书。1.4 引物序列及 qPCR 检测利用 NCBI 网站 Primerblast 进行引物设计，ABCA2 的参照基因序列为 NM_ 001606.5，上游引物为 5-CTCGTGCAC-CTCATGACCAG-3，下游引物为 5-GAGTCACGTTGCCCA-CAAAA-3。选 GAPDH 为内参基因，参照的基因序列为NM_002046，上游引物为 5-TGTTGCCATCAATGACCCCT-3，下游引物为 5-TCGCCCC
