1、 232 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 HPLC-ESI-MS/MS 同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的药物浓度 马英华，赵宜乐，秦亚彬，韩雨，姜锡娟，张古英(河北省儿童医院药学部，石家庄 050031)摘要：目的 建立基于高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-ESI-MS/MS)同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯浓度的方法，用于癫痫患儿的血药浓度监测及结果分析。方法 样品用有机溶剂沉淀蛋白法进行前处理，分别以丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比
2、妥-D5 为内标，采用 Phenomenex Kinetex EVO C18色谱柱(2.1 mm50 mm，2.6 m)，以 0.07%甲酸-1 mmol 乙酸铵-水(A)和甲醇(B)作为流动相进行梯度洗脱，流速为 0.5 mLmin1。质谱检测系统采用电喷雾离子源负离子模式，多离子反应监测模式扫描。考察该方法的专属性、定量下限(LLOQ)、标准曲线、残留效应、稀释效应、准确度、精密度、基质效应和稳定性。结果 丙戊酸在 0.6120 gmL1线性关系良好(r=0.998 9)，LLOQ 为 0.6 gmL1；苯巴比妥在 0.2550 gmL1线性关系良好(r=0.999 1)，LLOQ 为 0
3、.25 gmL1；托吡酯在 0.2550 gmL1线性关系良好(r=0.999 0)，LLOQ 为 0.25 gmL1。批内和批间精密度 RSD8.0%，稳定性良好，不受普通基质和溶血基质(溶血程度5%)的影响，方法学验证均符合中国药典 2020 年版规定。结论 本方法快速、简便、稳定、经济，具有较高的灵敏度和特异性，可应用于监测临床癫痫患儿丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的血药浓度。关键词：丙戊酸；托吡酯；苯巴比妥；高效液相色谱串联质谱；血药浓度监测；儿童 中图分类号：R917.101 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2023)02-0232-06 DOI:10.13748/ki.is
4、sn1007-7693.2023.02.012 引用本文：马英华,赵宜乐,秦亚彬,等.HPLC-ESI-MS/MS 同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的药物浓度J.中国现代应用药学,2023,40(2):232-237.Simultaneous Determination of Valproic Acid,Phenobarbital and Topiramate in Plasma of Epileptic Children by HPLC-ESI-MS/MS MA Yinghua,ZHAO Yile,QIN Yabin,HAN Yu,JIANG Xijuan,ZHANG Guyi
5、ng(Department of Pharmacy,Childrens Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050031,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a method for simultaneous determination of valproic acid,phenobarbital and topiramate in plasma of epileptic children by high performance liquid chromatography-tandem mass spectro
6、metry(HPLC-ESI-MS/MS).METHODS The samples were pre-treated by precipitation protein method with organic solvent.Valproic acid-D6,topiramate-D12,and phenobarbital-D5 were used as internal standard.Chromatographic column:Phenomenex Kinetex EVO C18(2.1 mm50 mm,2.6 m);flow phase:0.07%formic acid-1 mmol
7、ammonium acetate-water(A)and methanol(B),gradient elution;flow speed:0.5 mLmin1.Ion source was electric spray ion source,multireaction monitoring mode for quantitative analysis,using negative ion monitoring mode.The specificity,lower limit of quantitation(LLOQ),standard curve,residual effect,dilutio
8、n effect,accuracy,precision,matrix effects and stability were investigated.RESULTS The linear range of valproic acid was 0.6120 gmL1(r=0.998 9),and LLOQ was 0.6 gmL1.The linear range of phenobarbital was 0.2550 gmL1(r=0.999 1),and LLOQ was 0.25 gmL1.The linear range of topiramate was 0.2550 gmL1(r=0
9、.999 0),and LLOQ was 0.25 gmL1.The intra-batch and inter-batch precision RSD was 8.0%,with good stability,and this method was not affected by common matrix and hemolysis matrix(hemolysis degree 5%).The methodology validation was in line with the provisions of Chinese Pharmacopoeia(2020 edition).CONC
10、LUSION This study determined the blood concentration of valproic acid,phenobarbital and topiramate in children with HPLC-ESI-MS/MS,which is rapid,simple,stable,economical,and high sensitivity and specificity.It can be applied to therapeutic drug monitoring of valproic acid,phenobarbital and topirama
11、te in clinical children with epilepsy.KEYWORDS:valproic acid;topiramate;phenobarbital;HPLC-ESI-MS/MS;therapeutic drug monitoring;children 基金项目：河北省卫生健康委医学科学研究课题计划项目(20211469)作者简介：马英华，女，硕士，主管药师 E-mail: 癫痫是一种慢性神经系统疾病，特征是由异常神经元放电而引起大脑短暂功能障碍，全世界约有5 000万人患有这种疾病1-2。治疗癫痫的首要方案就是抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs
12、)中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 233 治疗，通常采用单一用药或联合用药的方式进行治疗，而根据新诊断儿童癫痫的初始单药治疗专家共识3，丙戊酸(valproic acid，VPA)是多种癫痫类型的初始单药首选药物，治疗效果较好。苯巴比妥(phenobarbital，PHB)也有较好的镇静和抗癫痫效果，广泛用于新生儿和儿童癫痫发作，以及耐药的惊厥和非惊厥性癫痫持续状态4-5。但由于传统AEDs具有非线性药动学特点，治疗范围狭窄，不良反应较多，血药浓度波动范围大，临床效应与血
13、药浓度的关系密切，需要定期进行治疗药物监测6-7。而新型AEDs托吡酯(topiramate，TPM)也经常作为联合用药的一线二线用药，其对癫痫的多种发作类型有效，且不易产生耐药性，一般用于初诊为癫痫的患者或曾经合并用药现转为单药治疗的癫痫患者8。但TPM在儿童和婴幼儿有更高的清除率和分布容积，血药浓度偏低，而肝肾功能不全的患者服用TPM后，清除率会降低9。同时与TPM的用药剂量和控制加量速率有关的不良反应有泌汗障碍、影响生长发育和认知功能10。因此为了患儿用药的安全性和有效性，临床需要通过对AEDs进行治疗药物监测，定期监测血药浓度，及时调整优化给药方案，降低不良反应发生率，使患者得到更安全
14、、合理的药物治疗，尤其是儿童患者。目前，大多数医院开展AEDs的治疗药物监测多采用均相酶放大免疫法、化学发光免疫分析、荧光偏振免疫分析法或HPLC。免疫法试剂盒酶活性受环境影响大，且待测物受结构类似物干扰影响检测的准确度和特异性。而近几年由于HPLC-MS/MS具有较高的色谱分离能力和质谱选择性，并且可以同时检测多种药物，特异性、灵敏性高，所以应用该法测定该类物质越来越普遍。但是应用HPLC-MS/MS检测生物样品时，内源化合物可能会对目标化合物的离子化效率产生影响，从而影响分析的准确性，而稳定同位素标记内标(stable isotope labeling-internal standard，
15、SIL-IS)可以抵消基质效应的影响。通过查阅文献，国内外尚无采用同位素内标法同时检测VPA、PHB和TPM血浆中浓度的方法，基于此，本实验室建立一种简单、快速、灵敏度高的高效液相色谱-质谱联用方法(HPLC-ESI-MS/MS)同时测 定癫痫患 儿血浆 中VPA、PHB和TPM的浓度，大大提高了检测效率，节约了仪器成本，同时稳定同位素作为内标提高了分析的准确度和精密度，从而为临床上AEDs治疗药物监测和个体化精准给药方案提供方法技术依据。1 仪器与试剂 1.1 仪器 Triple QuadTM 4 500MD液相色谱串联质谱检测系统，配有三重四级杆质量分析器，Toubo V电喷雾离子源(AB
16、 SCIEX 公司)；JasperTM HPLC 20ADxr(日本岛津)；Analyst 1.6.3 MD软件(AB SCIEX公司)；Explorer R准微量天平(Ohaus 公司)；WH-861型旋涡混合器(太仓市华利达实验设备有限公司)；BY-R20型高速冷冻离心机(北京白羊医疗器械有限公司)。1.2 药品与试剂 VPA(CAS：99-66-1；批号：100963-201705)、TPM(CAS：97240-79-4；批号：100783-201502)、VPA-D6(批号：100142-201705)、TPM-D12(CAS：1279037-95-4；批 号：100597-201503)均 购 自Toronto Research Chemicals(CAN)；PHB(CAS：50-06-6；批号：MFCD00066494)、PHB-D5(1 mL甲醇中含1.0 mg，批号：FE03052010)均购自Supelco(USA)。甲醇色谱级，Fisher Chemical，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；乙腈、甲酸(色谱级，美国Mreda technology inc)；水为纯净
