1、FOL1 表达对乳腺癌患者预后价值及相关生物学行为的影响研究朱超，张立功，郭晨旭，殷发祥，许睿，钱军(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科中德乳腺病区，安徽蚌埠233000)摘要:目的研究叶酸受体 1(Folatereceptor 1，FOL1)在乳腺癌患者中的表达情况及预后价值，并检测 FOL1 的表达对相关细胞系增殖的影响。方法收集 10 例新鲜乳腺癌及癌旁正常组织，实时荧光定量 PC(qTPC)检测两组 FOL1蛋白表达差异，同时收集 80 例乳腺癌患者临床病理学资料及预后情况，免疫组化检测 80 例癌组织及癌旁正常组织蜡块表达情况，并分析 FOL1 表达与临床病理学特征及预后之间的相关性。通
2、过 siNA 转染乳腺癌细胞 MCF7，敲低 FOL1 表达量，qTPC 验证转染效率。其次，通过 CCK8 实验检测 MCF7 细胞增殖变化;Western blot 检测 PI3K/Akt 信号通路的蛋白表达量变化。结果与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织中 FOL1 表达量明显增高(P005)，FOL1 在乳腺癌中的表达量与肿瘤大小(P=0027)、Ki67(P=0031)、TNM 分期(P=0041)有关。并且 FOL1 表达量越高，患者生存率越低。敲低 MCF7 细胞FOL1 蛋白表达量后，细胞增殖能力明显降低(P005)，并且 pPI3K 和 pAkt 在细胞中表达量均明显降低(P005
3、)。结论FOL1 在乳腺癌中表达明显升高，并且 FOL1 表达影响乳腺癌患者的预后，这可能与调控 PI3K/Akt 信号通路改变乳腺癌细胞增殖具有一定相关性。关键词:叶酸受体 1;乳腺癌;预后;增殖中图分类号:7379文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01002105基金项目:蚌埠医学院自然科学基金(2021byzd078);安徽省教育厅科学研究项目(KJ2021A0816)作者简介:朱超(1989)，男，硕士研究生，主治医师，研究方向:乳腺肿瘤外科治疗。通讯作者:钱军，主任医师，研究方向:乳腺肿瘤外科治疗。FOL1 expression prognostic value i
4、n patients with breast cancer and related biological behavior researchZHU Chao et al(Sinogerman Breast Ward of Oncology Surgery，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China)Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and prognostic value of FOL1 in breast cancer pa
5、tients，and to detect thephenotypic effects of FOL1 expression on related cell linesMethods10 cases of fresh breast cancer and normal adjacent tissueswere collected，and the expression of FOL1 protein was detected by realtime quantitative PC(qTPC)Meanwhile，the clinico-pathological data and prognosis o
6、f 80 cases of breast cancer were collected，and the expression of wax block in cancer tissues and nor-mal adjacent tissues of 80 cases were detected by immunohistochemistryThe correlation between FOL1 expression and clinicopatholog-ical features and prognosis was analyzedBreast cancer cells MCF7 were
7、 transfected with siNA，FOL1 expression was knocked down，and the transfection efficiency was verified by qTPCSecondly，the proliferation of MCF7 cells was detected by CCK8 assayWest-ern blot was used to detect the protein expression of PI3K/Akt signaling pathwayesultsThe expression level of FOL1 in br
8、eastcancer tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues(P005)The expression level of FOL1 in breast cancerwas correlated with tumor size(P=0027)，Ki67(P=0031)and TNM stage(P=0041)The higher the FOL1 expression，thelower the survival rateAfter knockdown of FOL1 protein expressi
9、on level in MCF7 cells，cell proliferation ability was significantly de-creased(P005)，and pPI3K and pAkt expression levels in MCF7 cells were significantly decreased(P005)ConclusionTheexpression of FOL1 is significantly increased in breast cancer，and the expression of FOL1 affects the prognosis of br
10、east cancer pa-tients，which may be related to the regulation of PI3K/Akt signaling pathway to change the proliferation of breast cancer cellsKey words:Folatereceptor 1;Breast cancer;prognosis;proliferation乳腺癌是全世界妇女最常见的癌症及癌症死亡原因。2021 年有 167 万乳腺癌新确诊病例，占所有癌症的 25%，522 万人死于此疾病1。在我国，虽然化疗、放疗及手术治疗不断运用于临床，但因
11、乳腺癌发现不及时，患者预后仍较差，因此需尽快找到乳腺癌发病机制及治疗靶点，早诊断早治疗，才能提高乳腺癌患者预后生存2。FOL1 也称为叶酸结合蛋白和叶酸受体，该基因位于染色体 11q133141上，是一种糖基磷脂酰肌醇连接蛋白。FOL1 对叶酸具有很强的亲和力，能够内化叶酸3。最新报道122023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.018显示，FOL1 参与 DNA 复制和损伤修复，其表达水平与细胞
12、增殖和肿瘤进展密切相关45。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)信号通路是一组细胞内脂质激酶，负责磷酸化参与代谢和生长的多种细胞酶6。已有研究表明，在宫颈癌中，FOL1 通过调控 PI3K/Akt 信号通路，改变宫颈癌细胞生长7。但在乳腺癌中未曾有报道 FOL1 对乳腺癌细胞相关表型及机制的影响，本文主要通过分析 FOL1 在乳腺癌中及癌旁正常组织的表达差异，揭示 FOL1 是否影响乳腺癌患者生存状况，并探讨相关机制。1对象与方法11研究对象收集蚌埠医学院第一附属医院2017 年1 月至2017
13、 年12 月经外科手术切除的乳腺癌组织及相对应的癌旁正常组织蜡块，共 80 例，均为女性，年龄(52316)岁。同时收集 2022 年 1 月至 3 月在肿瘤外科进行乳腺癌改良根治术切除的癌组织及癌旁正常组织(距离癌切缘3 cm)，共 10例。纳入标准:(1)有明确病理诊断为乳腺癌;(2)术前未接受过任何治疗;(3)有完整的临床病理数据及随访资料。排除标准:(1)男性乳腺癌;(2)复发及转移性乳腺癌;(3)术前接受过任何治疗的患者。从医疗记录及病理报告获取患者年龄、肿瘤大小、Ki67、淋巴结转移、肿瘤分化程度，并根据病理学评估出患者 TNM 分期。所有患者均签署知情同意书，并由蚌医一附院伦理委
14、员会批准。12主要试剂乳腺癌细胞 MCF7 购于上海中科院细胞库;FOL1、AKT、PI3K、pAKT、pPI3K、GAPDH一抗、IgG 二抗均购于中国武汉三鹰公司;SYBGreen 试剂盒及反转录试剂盒由中国上海碧云天公司生产;qTPC 由中国上海吉凯基因公司提供。13qTPC 测定 mNA 表达量取相应组织，TIzol 法提取总 NA，逆转录变为 cDNA。加入引物，模板为 cDNA，GAPDH 作为内参，通过 2Ct方法得出 FOL1 相对表达量。反应条件:变性 94 15 s、退火 58 34 s、延伸 73 35 s，共 40 个循环。引物序列:FOL1 正向序列:5 GAATGC
15、CTGCT-GTTCTACCA3;反向序列:5 CCACCCTTCTAA-CAGCGT 3。GAPDH 正向序列:5 CAGAGC-CTCGCCTTTGCCGA3;反向序列:5 ACGCCCT-GGTGCCTGGGGCG3。14免疫组化检测 FOL1 蛋白及分析取组织蜡块，通过切片组织、脱腊、复水并进行抗原修复后，滴加足量 FOL1 一抗(1 100)，4 孵育过夜。清洗后，滴加二抗(1 1 000)，常温孵育 30 min。DAB试剂盒染色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。胞浆及胞质中的黄染颗粒即为 FOL1 蛋白。免疫组化结果判断:高倍视野(200)每例组织随机取 5 个视野，
16、将阳性细胞占比分数和染色强度的乘积作为判断依据。染色强度为 0 分=未染上色，1 分=浅黄色，2 分=棕黄色，3 分=棕褐色;阳性细胞所占细胞数目百分比计分，0 分=0%，1 分为占比10%，2 分为占比 11%50%，3 分占比 51%75%，4 分为占比75%。分数在 0 4 分为 FOL1低表达组，412 分为 FOL1 高表达组。所有评分结果由两名以上高年资病理医师单独读片判定。15细胞培养及转染乳腺癌细胞 MCF7 由 10%胎牛血清和 1%的青链霉素溶液配置成的 DMEM 高糖培养基进行培养，置于 37，5%CO2的细胞培养箱中。当细胞处于对数生长期时，运用脂质体 Li-po3000 按照说明书将 siNC 及 siFOL1 片段转染进入细胞内。16Western blot 检测蛋白表达通过 ipa 裂解提取蛋白质，BCA 试剂盒测定浓度，SDSPAGE 电泳分离蛋白质。再将蛋白转移至 PVDF 膜。之后5%脱脂牛奶粉封闭，室温 1 h。TBST 洗 3 遍加入一抗(FOL1、AKT、PI3K、pAKT、pPI3K 浓度均为 1 500)，4 下孵育过夜。去除一抗，加二抗(
