1、HA 复合-TCP 在新西兰兔上颌窦提升术中的成骨及成血管效果张艳波霍峰王雪峰韩尚志张兴乐王鹏(承德医学院附属医院口腔科，河北承德067000)摘要 目的探讨羟基磷灰石(HA)复合-磷酸三钙(TCP)对新西兰大白兔上颌窦提升术中的成骨和成血管的影响。方法细胞实验部分，提取新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs);将细胞分为空白组(不进行任何处理)、对照组(细胞的培养基中添加 1%的-TCP 后培养)、实验组(细胞的培养基中添加 1%的 HA 复合-TCP 材料);CCK-8 实验检测 HA复合-TCP 材料对 BMSCs 的生长活性的影响，茜素红、碱性磷酸酶染色检测 HA 复合-TCP 材
2、料对 BMSCs 的成骨分化的影响。将生理盐水、1%-TCP、HA 复合-TCP 材料依次应用到空白组、对照组、实验组新西兰大白兔的上颌窦提升术中;免疫组化检侧各组标本中的微血管密度(MVD)，Western 印迹检测各组标本中成骨相关蛋白成骨基因特异性转录因子(unx)2、骨桥蛋白(OPN)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果与空白组相比，实验组、对照组细胞的生长活性无明显差异(P0.05)，实验组、对照组细胞矿化结节数量、碱性磷酸酶的阳性比例明显升高(P0.05);与对照组相比，实验组细胞矿化结节数量、碱性磷酸酶的阳性比例明显升高(P0.05);与空白组相比，实验组、对照组上颌窦
3、组织中的 MVD 明显增多，上颌窦组织中unx2、OPN、VEGF 表达明显升高(均 P0.05)，与对照组相比，实验组上颌窦组织中的 MVD 明显增多，上颌窦组织中 unx2、OPN、VEGF 表达明显升高(均 P0.05)。结论HA 复合-TCP 材料能明显增强 BMSCs 体外成骨的分化及成血管效用，增强新西兰兔上颌窦提升术中的成骨及成血管效果。关键词 上颌窦提升;骨替代材料;羟基磷灰石;-磷酸三钙;成骨和成血管中图分类号 781.3 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0643-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.0
4、35基金项目:河北省医学科技研究课题(20211447);承德市科学技术研究与发展计划项目(202006A167)通信作者:霍峰(1965-)，男，硕士，主任医师，主要从事口腔医学研究。第一作者:张艳波(1978-)，男，硕士，主治医师，主要从事口腔医学研究。由社会老龄化、面部创伤、肿瘤切除、先天性畸形及炎症等因素导致的上颌后区骨量不足以致牙槽骨骨缺失是口腔临床医学面临的重大挑战之一。在上颌窦提升术中，有效的修复及重建骨缺损是使患者免于疾病困扰的惯用治疗方案1。研究显示2，自体骨移植修复材料能明显促进骨的再生和愈合，是修复缺失骨的“金标准”，但是该方法需要从患者身体其他部位获取，患者要承受新的
5、疼痛或者神经创伤，诱发较为强烈的炎性应激等并发症，并且由于自体骨的增殖能力有限，难以满足临床上较大的骨需求量。大量的临床数据显示3置入式骨替代材料在硬组织修复中具有潜在的广阔前景。研究显示4羟基磷灰石(HA)、-磷酸三钙(-TCP)等替代骨材料常被骨外科医师用于骨增量手术中。有研究报道5，HA 具有明显的生物相容性优势，可为骨再生提供较为稳定的支架作用，但是其被生物降解的过程缓慢，严重影响初期骨的形成。有研究报道称6，-TCP 在骨组织修复中显示了更好的生物降解速率，但其作为支架作用的缺点同样较为明显，无法在 3 6 个月的骨组织重建过程维系骨替代材料降解与成骨过程的平衡。Sakamoto 等
6、7研究表明将 HA 复合-TCP 应用到骨重建术中，显示了较为满意的成骨效果。但是 HA 复合-TCP 材料用于上颌骨的修复的报道较少。本研究探讨 HA 复合-TCP 对新西兰大白兔上颌窦提升术中的成骨和成血管的影响。1材料和方法1.1实验动物、试剂和仪器动物:雌性，SPF 级，3月龄，体重(2.50.5)kg，31 只，健康新西兰大白兔，采购自河北省望都县彤辉养殖有限公司，动物的许可证号:SCXK(冀)2016-002，实验动物使用许可证号 SYXK(冀)2017-001。在承德医学院实验动物中心饲养房中，恒温恒湿条件下，标准颗粒饲料，自由饮水，单笼饲养，至少进行适应性喂养 1 w 后用于后
7、续实验。本研究的实验操作均符合医学院动物伦理委员会的要求，已获取承德医学院动物伦理委员会的批准。主要试剂:HA 复合-TCP(HA 和-TCP的比例为 3 7)购自国家生物医学材料工程技术中心。-TCP、麻醉剂、磷酸盐缓冲液(PBS，北京 Solar-bio 公司)，兔抗大鼠 GAPDH(北京博奥森生物技术公司);苏木素-伊红(HE)试剂盒(美国 Amresco 公司)，免疫组化、Western 印迹试剂盒(美国 millipore公司)，茜素红、油红 O 染色试剂盒(南京建成生物346张艳波等HA 复合-TCP 在新西兰兔上颌窦提升术中的成骨及成血管效果第 3 期工程有限公司)。主要仪器:扫
8、描电镜(日本 HITA-CHI 公司)，光学显微镜(日本 Olympus 公司)，酶标仪(北京六一仪器厂)，FACS Aria 流式细胞仪、凝胶电泳仪(美国 BD 公司)。1.2电镜观察 HA 复合-TCP 生物材料的特性在实验前将无菌真空包装的 HA 复合-TCP 材料切成直径 3 mm，高度为 5 mm 的形状，电镜下观察复合材料的微观结构。1.3细胞实验部分1.3.1新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离、鉴定与培养取 1 只实验动物，静脉注射30 mg/kg的 3%戊巴比妥钠麻醉后，剥离大白兔的股骨8，PBS 冲洗 3 次，将冲洗出来的骨髓离心，弃上清，以浓度为 15%胎牛血清
9、(FBS)的 DMEM 培养液重悬细胞，置于 37，5%CO2细胞培养箱中培养，每隔 1 d 更换一次培养，并在显微镜下随时观察细胞的形态及生长变化当细胞的生长密度超过90%时，0.25%胰酶消化，用于后续实验。BMSCs的表面抗原鉴定通过流式细胞仪进行，胰酶消化细胞后，1 500 r/min 离心 3 min，PBS 洗涤，以 100 l的 PBS 重悬细胞，加入一抗(CD29、CD34、CD44、CD45)，室温下孵育 30 min，PBS 冲洗 3 次，加入二抗，避 光 孵 育 2 h，FACS Aria 流 式 细 胞 仪检测9。1.3.2细胞实验分组及 HA 复合-TCP 材料对BM
10、SCs 的生长活性的影响胰酶消化细胞后，调整细胞浓度为 1104个/孔接种于 96 孔培养板中，将细胞分为空白组(不进行任何处理)、对照组(细胞的培养基中添加 1%的-TCP 后培养)10、实验组(细胞的培养基中添加 1%的 HA 复合-TCP 材料)，每组设 18 个复孔，置于 37，5%CO2细胞培养箱中培养 24 h，接着每孔加入 100 l 的 CCK-8 工作液，室温孵育1 h，使用酶标仪11在12、24、36、48、60、72 h 时各取 3 个孔测量 D450。1.3.3HA 复合-TCP 材料对 BMSCs 的成骨分化的影响胰酶消化细胞后，更换为成骨诱导培养基同时调整细胞浓度为
11、 1104个/孔接种于 96 孔培养板中，分组同 1.3.2，置于 37，5%CO2细胞培养箱中培养，每隔 1 d 更换培养基，培养 14 d 后，按茜素红、碱性磷酸酶染色试剂盒12，染色，封片，显微镜下观察 BMSCs 的成骨和成血管状况。1.4动物实验部分1.4.1新西兰大白兔的上颌窦提升术将实验动物按随机数字表法分为空白组、对照组、实验组，每组 10 只;实验动物禁食禁水 12 h 后，耳静脉注射戊巴比妥钠将动物麻醉后13，严格按手术要求在鼻部术区备皮，消毒，与动物鼻后 1.5 cm 处行纵行切口，在无菌显微剪的帮助下，分开两侧皮肤，暴露大白兔的鼻翼区，使用环形去骨钻在上颌窦顶壁制备以直
12、径为 0.5 cm 的骨窗，取下骨片，分开上颌窦黏膜，复制出 5 cm5 cm5 cm 的空间:空白组在该处填充医用生理盐水和明胶海绵;对照组在该处填充 1%-TCP、医用生理盐水和明胶海绵;实验组在该处填充 1%的 HA 复合-TCP 材料、医用生理盐水和明胶海绵，盖上自体骨，缝合骨膜，肌注 20 万 U 的青霉素防止感染。1.4.2HE 染色检侧实验动物上颌窦组织的形态改变所有大白兔在术后单笼，标准饲料喂养 28 d后，处死动物，无菌分离实验动物的上颌窦组织。以多聚甲醛固定，置于脱钙液中3 个月，每3 d 更换脱钙液，待医用大头针能轻易穿刺标本后14，脱水，切片，HE 染色，显微镜下观察标
13、本中的成骨和成血管情况。1.4.3免疫组化检侧各组标本中的微血管密度(MVD)待各组标本脱钙后，常规脱水，切片，采用柠檬酸盐缓冲液高温修复抗原，5%山羊血清封闭，加入一抗 CD31(1 500)15，4 孵育过夜，加入二抗，PBS 润洗 3 次，苏木精复染，二甲苯脱水，封片，上镜检测。1.4.4Western 印迹检测各组标本中成骨相关蛋白成骨基因特异性转录因子(unx)2、骨桥蛋白(OPN)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平待各组标本脱钙后，经常规裂解、匀浆、离心后，测定蛋白浓度，电泳分离，转模、封闭12，滴加一抗(均为1 500)，4孵育过夜，次日清洗后加入二抗(均为1 1 000)
14、，显色，凝胶成像仪下读取各条带灰度值16，参照 GAPDH 的表达计算目的蛋白相对表达水平。1.5统计学分析采用 SPSS16.0 软件进行方差分析，t 检验，作图工具采用 Graphpad5.01。2结果2.1电镜下观察复合材料的微观结构扫描电镜观察显示，HA 复合-TCP 材料内部的微孔(直径300 500 m)和超微孔(直径 1 m)数量丰富，孔径率在 85%左右，视野中的微孔均在内部链接紧密，为新血管以及骨骼的形成提供足够的空间和营养，见图 1。2.2BMSCs 的培养与鉴定光学显微镜下，BMSCs多为长梭形、椭圆形或多边形，贴壁生长呈现旋涡446中国老年学杂志 2023 年 2 月第
15、 43 卷状、鱼群状排列;BMSCs 表面阳性标记物 CD29(62.782.94)%，CD44(93.739.18)%，呈现高表达的状态，而 CD34，CD45 均为阴性表达，这些结果说明所提取的细胞为 BMSCs，见图 2。2.3HA 复合-TCP 材料对 BMSCs 的生长活性的影响3 组细胞的 OD 值无明显差异(P0.05)，说明 3 组细胞的生长的增殖活性趋于一致，进而显示 HA 复合-TCP 材料对 BMSCs 无毒性，见表 1。图 1电镜扫描生物材料的微观结构图 2BMSCs 的培养与鉴定表 1各组细胞的 OD 值(xs，n=8)组别12 h24 h36 h48 h60 h72
16、 h空白组0110 020 200040420050580060630070 780 08对照组0100 010 190030400040540050620060 770 07实验组0100 010 190050410050550060600050 780 062.4HA 复合-TCP 材料对 BMSCs 的成骨分化的影响空白组细胞中未见明显的矿化结节，对照组细胞中可见少量的矿化结节，实验组细胞中可见较多的矿化结节，3 组细胞的矿化结节数量的差异具有统计意义(均 P0.05)，见图 3，表 2。图 3各组 BMSCs 茜素红染色(400)2.5HA 复合-TCP 材料对 BMSCs 的成骨中血管生成的影响空白组细胞中未见明显的咖啡色颗粒，对照组细胞中可见少量的咖啡色颗粒，实验组细胞中可见较多的咖啡色颗粒，与空白组相比，对照组、实验组细胞中碱性磷酸酶的阳性比例明显升高，与对照组相比，实验组细胞中碱性磷酸酶的阳性比例明显升高(均 P0.05)，见表 2，图 4。表 2各组细胞矿化结节数量、碱性磷酸酶的阳性比例比较(xs，n=8)组别矿化结节数量(个)碱性磷酸酶的阳性比例(%)空白组4512
