1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）Caspase-1依赖的细胞焦亡在HIV-1感染导致pDCs损耗中的作用研究*覃凤翔，洪雯，刘洁，袁宗祥，蒋俊俊，叶力（广西医科大学公共卫生学院广西艾滋病防治研究重点实验室，南宁530021）摘要目的：探讨Caspase-1依赖的细胞焦亡在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染者外周血浆细胞样树突状细胞（pDCs）损耗中的作用机制。方法：比较HIV-1感染者与健康志愿者外周血pDCs细胞频率和细胞焦亡水平。体外诱导分化人单核细胞白血病细胞THP1来源的树突状细胞（DCs）（T
2、HP1-DCs），分为阴性对照组、HIV-1感染组、阴性对照+HMGB1抑制剂甘草酸组和HIV-1感染+甘草酸组。检测HIV-1感染或不感染THP1-DCs的细胞焦亡、HMGB1释放、Caspase-1/GSDMD信号轴激活水平。结果：HIV-1感染者外周血单个核细胞（PBMCs）中pDCs细胞频率显著低于健康志愿者（P=0.001）。HIV-1感染者pDCs细胞焦亡水平以及Caspase-1、GSDMD、白介素（IL）-1、HMGB1 mRNA表达水平升高（P0.05）。与阴性对照组比较，HIV-1感染组THP1-DCs的HMGB1、Caspase-1、GSDMD以及IL-1和IL-18表达
3、水平升高（P0.05）；与HIV-1感染组比较，HIV-1感染+甘草酸组细胞焦亡以及Caspase-1、GSDMD、IL-1和IL-18 mRNA和（或）蛋白表达水平降低（P0.05）。结论：HIV-1感染可通过激活Caspase-1/GSDMD信号轴，释放IL-1和IL-18等炎症因子，诱发pDCs细胞焦亡，可能是HIV-1感染者外周血pDCs细胞损耗的重要原因。关键词人类免疫缺陷病毒1型；浆细胞样树突状细胞；高迁移率族蛋白B1；细胞焦亡中图分类号：R392.9文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1867-09DOI：10.16190/ki.45-1211/r.202
4、2.12.002The role of Caspase-1 dependent pyroptosis in plasmacytoid dendritic cells depletion causedby HIV-1 infectionQin Fengxiang,Hong Wen,Liu Jie,Yuan Zongxiang,Jiang Junjun,Ye Li.(School of Public Health,GuangxiMedical University,Guangxi Key Laboratory ofAIDS Prevention and Control Research,Nanni
5、ng 530021,China)AbstractObjective:To explore the mechanism of Caspase-1 dependent pyroptosis in the peripheral blood plas-macytoid dendritic cells(pDCs)depletion in patients infected with human immunodeficiency virus type 1(HIV-1).Methods:The frequency of pDCs cells in peripheral blood of HIV-1 infe
6、cted and healthy volunteers and thelevel of pyroptosis were compared.Induced differentiation of dendritic cells(DCs)derived from human monocyt-ic leukemia cells THP1(THP1-DCs)in vitro were divided into negative control group,HIV-1 infection group,negative control+HMGB1 inhibitor glycyrrhizic acid gr
7、oup and HIV-1 infection+glycyrrhizic acid group.Py-roptosis,release of HMGB1,and activation of Caspase-1/GSDMD signal axis were detected in HIV-1 infectedand non-infected THP1-DCs cells.Results:The frequency of pDCs in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of HIV-1 patients was significantly lowe
8、r than that of healthy volunteers(P=0.001).The pyroptosis lev-el and mRNA expressions of Caspase-1,GSDMD,interleukin(IL)1 and HMGB1 increased in HIV-infectedpDCs(P0.05).Compared with the negative control group,the expressions of HMGB1,Caspase-1,GSDMD,IL-1 and IL-18 of THP1-DCs in HIV-1 infection gro
9、up increased(P0.05);compared with HIV-1 infection group,pyroptosis and mRNA and/or protein expressions of Caspase-1,GSDMD,IL-1 and IL-18 in HIV-1+glycyrrhe-ic acid group decreased(P0.05).Conclusions:HIV-1 infection can induce pyroptosis of pDCs cells by activat-ing the Caspase-1/GSDMD signaling axis
10、,and releas-ing IL-1,IL-18 and other inflammatory factors,which may be an important reason for pDCs deple-*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.31860040）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-12-05艾滋病研究专栏 1867广西医科大学学报2022 Dec；39（12）tion in peripheral blood of HIV-1 infected patients.Keywordshuman immunodeficiency virus type 1;plasm
11、acytoid dendritic cells;high mobility group proteinB1;pyroptosis树突状细胞（DCs）是人类免疫缺陷病毒（HIV）侵入机体后在黏膜感染途径中首先接触到的细胞之一，在HIV传播中扮演重要角色1。根据来源不同，DCs 分为髓样 DCs（mDCs）和浆细胞样 DCs（pDCs）。既往研究表明，HIV-1感染可导致外周血pDCs细胞数量减少，造成人体非特异和特异性免疫下降甚至崩溃，最终导致患者发生肿瘤和机会性感染等的风险增加，影响病程的进展和预后2-4，但其机制尚未完全清楚。由于HIV-1仅可低水平感染pDCs5，因此，HIV-1病毒的直接
12、破坏并不能完全解释HIV-1感染者外周血中pDCs损耗的现象6。目前的研究主要认为pDCs迁移至淋巴结以及自发的细胞凋亡是病毒感染导致外周血pDCs损耗的可能原因7-10，但这些证据仍较为有限。近年来研究报道，Caspase-1介导的细胞焦亡可能是HIV-1感染过程中绝大部分静息CD4+T细胞死亡的重要原因，这一过程还同时伴随白介素（IL）-18和IL-1的释放以及一系列慢性炎症反应11。那么，细胞焦亡是否也参与HIV-1感染所致的pDCs细胞数量损耗？本研究旨在探讨HIV-1感染导致pDCs发生细胞焦亡的表象，结合体外诱导分化的人单核细胞白血病细胞（THP1）来源的DCs（THP1-DCs）
13、模型，探讨细胞焦亡在HIV-1感染导致pDCs损耗中的作用和分子机制，以期为抗病毒治疗（ART）患者免疫重建和HIV-1感染的防治提供新的研究思路。1材料与方法1.1标本收集收集 19 例 HIV-1 感染者（年龄18岁、HIV检测为阳性且已接受超过6个月的ART，无其他重大疾病）和14例健康志愿者（年龄18岁、HIV检测为阴性，无其他重大疾病）的外周静脉血20 mL。本研究已取得广西医科大学人体研究伦理委员会批准（审批号：2019-SB-102），所有研究对象均对本研究知情并已签署知情同意书。1.2细胞、病毒和主要试剂THP1细胞系购自中科院上海细胞库。HIV-1 89.6病毒由中国疾病预防
14、控制中心病毒库惠赠。RPMI1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；荧光抗体Human Hematopoi-etic Lineage-FITC、HLA-DR-APC标记、CD123-PE-Cyanine7（美国Thermo公司）；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子-（rhTNF-）（联科生物）；Inomycin钙离子载体（InvivoGen公司）；甘草酸（百灵威科技有限公司）；CD304（BDCA-4/Neuro-pilin-1）MicroBead Kit（德国美天旎公司）；FAM-FLICACaspase-1检测
15、试剂盒（北京达科为公司）；兔抗Gasdermin D（E8G3F）抗体、兔抗Cleaved Gas-dermin D（Asp275）（E7H9G）抗体、兔抗 Caspase-1（D7F10）抗体、兔抗高迁移率族蛋白B1（HMGB1）（D3E5）抗体和鼠抗-actin（8H10D10）抗体（美国CST公司）；荧光二抗（美国LI-COR公司）；HMGB1酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。1.3外周血pDCs分选取HIV-1感染者和健康志愿者的外周血，Ficoll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞（PBMCs）。严格按照磁珠试剂盒说明书操作，分选得到的pDCs经检
16、测，细胞纯度97%。1.4THP1-DCs 诱导分化和细胞分组用 rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-和Ionomycin 4种细胞因子处理THP1细胞，获取THP1-DCs12。在THP1-DCs体外感染HIV-1的同时加入0.8 mmol/L甘草酸，处理24 h后用PBS清洗2次，补充新鲜培养基后继续培养24 h。实验分为阴性对照组、HIV-1感染组、阴性对照+甘草酸组和HIV-1感染+甘草酸组。1.5细胞焦亡检测以人群 PBMCs 分选获得的pDCs为例，本实验的染色方案分组为HIV-1感染者pDCs染色组、HIV-1感染者pDCs空白组、健康志愿者pDCs染色组和健康志愿者pDCs空白组。严格按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪进行检测，FAM-FLICA 在 492 nm 激发，520 nm 发射，以 Cas-pase-1+PI+为细胞焦亡部分。1.6实时荧光定量PCR（RT-qPCR）采用Trizol法提取细胞总 RNA，逆转录为 cDNA，行 PCR 扩增。PCR 反应条件：95 预变性 30 s；95 变性 15 s，60 退火、延伸1 min，共40个循环。以GAP
