1、帕金森疾病动物模型的研究进展帕金森疾病动物模型的研究进展 本文关键词：帕金森，研究进展，模型，疾病，动物帕金森疾病动物模型的研究进展 本文简介：帕金森疾病（Parkinsonsdisease,PD）是一种神经退行性疾病，现多认为是遗传和环境因素相互作用的结果。典型特征是黑质纹状体中多巴胺神经元丧失以及多巴胺缺乏相关的典型帕金森运动特征。动物模型在说明PD的发病机制、测试新的治疗方案及药物的研究中，具有十分重要的作用。啮齿类动物、树鼩和帕金森疾病动物模型的研究进展 本文内容：帕金森疾病（Parkinsons disease,PD）是一种神经退行性疾病，现多认为是遗传和环境因素相互作用的结果。典型
2、特征是黑质纹状体中多巴胺神经元丧失以及多巴胺缺乏相关的典型帕金森运动特征。动物模型在说明PD的发病机制、测试新的治疗方案及药物的研究中，具有十分重要的作用。啮齿类动物、树鼩和灵长类动物等采用不同造模方法所建立的PD动物模型都拥有自己的优势和局限性，所表现出的临床特征和病理机制与人类有所不同。因此，在科学研究中选择所需使用的模型时必须仔细考虑。本文就主要神经毒素及转基因PD动物模型的相关研究进展进行综述。关键词：帕金森疾病； 6-羟基多巴胺； 1-甲基-4-苯基-1,; 2,; 3,; 6-四氢吡啶； 神经毒素； 转基因； 动物模型；帕金森疾病（Parkinsons disease,PD）是一种
3、由遗传和环境因素相互作用引起的复杂神经退行性疾病，发病机制尚不清楚。典型特征包括运动失常、路易体（Lewy bodies,LB）形成和黑质（substantia nigra,SN）中多巴胺（dopamine,DA）神经元的丧失1.PD在疾病的早期阶段有较好的对症治疗方法，但这些治疗方法并不会改变疾病的进程。因此，可以减缓或停止PD进展的干预措施仍是亟需实现的目标。PD动物模型有助于说明PD病因和发病机制，在新的治疗方法和药物研发中具有重大的应用价值。本文针对主要PD动物模型作一综述。大体上，PD的动物模型可以分为三类：基于靶向儿茶酚胺能神经元的神经毒素损伤模型、基于PD相关基因的转基因模型以及
4、二者的组合。目前每个模型都是模拟PD的一个或几个病理过程，每种模型都有自己的优点和局限，都不能完全模拟PD病理特点和疾病病症，可以根据实验目的选择适宜的实验方案。1 神经毒素模型1.1 6-羟基多巴胺模型6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）不能通过血脑屏障，其结构与DA神经递质相似，对DA质膜转运蛋白具有高亲和力，诱导DA神经元和去甲肾上腺素能神经元变性，通过触发氧化应激相关细胞毒性和小胶质细胞依赖性DA神经元炎症，引起其毒性机制2-4.斑马鱼腹侧间脑与人类黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）解剖学相似，Vijayan
5、athan等5将6-OHDA神经毒素（25 mg/kg）显微注射到斑马鱼腹侧间脑，3 d后，病理检测显示嗅球、端脑、中脑神经元损伤，并且行为学检测显示运动距离和速度明显下降，成功建立斑马鱼PD模型。Kamiska等6将不同剂量的6-OHDA（8、12、16 g/4 L）注入Wistar Han大鼠内侧前脑束（medial forebrain bundle,MFB），研究说明，使用最高剂量的6-OHDA且无地昔帕明预处理可诱发神经和行为学改变，可用于建立晚期PD伴抑郁症模型。Thiele等7的研究显示较小的注射体积和较慢的输注速率可确保MFB周围结构的最小损伤，防止损伤小鼠的饮食中心，具有高的造
6、模成功率和低的死亡率。成年大鼠的双侧SNc病变可出现危及生命的吞咽困难、渴感缺乏和运动障碍，所以很少使用。Kostrzewa等8采用双侧脑室内或脑池内6-OHDA给予围产期大鼠制作PD模型，该过程不致死、不缩短寿命，大鼠行为正常，可通过高剂量左旋多巴产生的运动障碍来区分。该模型导致黑质纹状体神经纤维近乎完全破坏（双侧99%）和去神经支配，类似于人类严重PD的神经化学状态，在评估抗PD药物方面具有显着的优势。狨猴纹状体注射6-OHDA可导致典型的PD运动障碍，SN中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）阳性细胞损失约63%,但无-突触核蛋白（-synuclein）表达的报
7、道9.Santana等10对狨猴MFB单侧多位点给予6-OHDA（4 mg/mL,10 L），8周后对侧采用同样处理方法，相比8周前，双侧处理的动物出现更严重且稳定的运动障碍，虽然有一定程度的自发恢复，32周期间总PD评分逐渐下降。说明两阶段神经毒性损伤程序会诱发持续数月的稳定运动病症，该模型适用于PD新疗法的长期评估。恒河猴中6-OHDA全身给药，可建立常见的PD非运动病症-心脏肥大症11.6-OHDA建模可选择纹状体、SN或MFB,6-OHDA所致的纹状体损伤在几周内中度持续，而MFB病变严重并且在1 2周内迅速开展12.MFB模型更适合于研究DA神经元死亡的后果，并测试治疗运动病症的治疗
8、策略，而纹状体模型可能更有助于说明PD的细胞死亡机制，并测试神经保护策略13-14.1.2 1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶模型1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine,MPTP）是脂溶性的，可以快速通过血脑屏障，主要通过氧化损伤和抑制线粒体呼吸链复合物杀死DA神经元15.这种模式再现了DA缺乏综合征，而不是DA神经元进行性变性的过程。小鼠MPTP损伤模型多出现PD运动障碍16-18,而Zhang等19采用雄性C57BL/6小鼠腹膜内注射MPTP30 mg/（kgd）连续
9、5 d,虽然纹状体DA神经元损伤、-synuclein水平升高且血脑屏障通透性改变，但没有明显的运动缺陷，推测可能是由于去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）系统和DA系统的补偿作用。Dauer等20指出黑质纹状体DA含量损失约60% 80%即DA神经元的损失量约40% 60%时，运动病症变得明显。丙磺舒可以防止神经毒素的肾去除并增加毒性代谢物MPP+的水平，使DA神经元产生显着不可逆的损失21.研究发现22-23用MPTP（25 mg/kg）加上丙磺舒（250 mg/kg）制作的C57/black小鼠慢性PD模型在第4周给药后运动障碍表现最明显，而且在5周的慢性方案中，非运动和运
10、动病症逐渐出现，小鼠SNc中会出现典型的PD特征，如-synuclein沉积物，是进行性PD的有效模型。采用雄性C57BL/6N小鼠皮下施用低剂量MPTP（20 mg/kg,每周3次）3个月，可建立小鼠慢性PD模型。该模型死亡率低，黑质纹状体DA神经元进行性退化，伴随着持续的神经炎症反响和运动缺陷，类似于PD的缓慢进行性神经变性过程。这种建模方式可能有助于建立不同阶段的PD,更好地了解疾病的病理生理学，可用于测试PD中的神经保护和修复治疗策略24.Pain等25评估了急性、亚急性和慢性的MPTP雄性C57BL/6小鼠模型，结果显示各组中纹状体DA含量损失一致（约60%），而TH活性和DA能转运
11、体水平减少取决于MPTP的累积剂量。虽然急性和亚急性中毒小鼠的中脑和海马5-羟色胺水平降低，但似乎不依赖于MPTP注射剂量，这与Rousselet等26研究结果一致。在食蟹猴中，慢性和延长的MPTP给药（0.3 mg/kg,静脉注射，间歇性两年，2岁给药，10年后处死），在剩余的SN神经元胞体和神经纤维结构中发现-synuclein积累、磷酸化的-synuclein免疫反响性，但无典型的LB发现27.猕猴连续低剂量0.1 mg/（kgd）MPTP皮下注射14 d后可出现中度PD病症，此后隔日注射一次，4次后猕猴出现不可逆性PD运动病症，且可自主摄食并长期存活28.李鹏等29对猕猴后小腿皮下静脉
12、缓慢注入MPTP溶液（0.2 0.4 mg/kg,间隔1 d,连续5次），3个月后评估模型情况。虽然猕猴出现典型帕金森运动病症、TH阳性纤维大量丧失，但未见到LB形成。史良琴等30采用恒河猴小剂量、长时间前臂肌内注射MPTP（0.2 mg/kg,45 d），动物可出现典型行为学病症，且观察到LB形成。但该方法存在时间长，脉冲式给药无法做到慢毒诱导，人为干扰大等因素。Ma等31对树鼩连续腹腔注射MPTP3 mg/（kgd）,5 d后出现典型的帕金森运动病症，且纹状体DA和DOPA水平显着降低，脑中-synuclein mRNA水平升高，提示树鼩可能是研究PD发病机制的潜在动物模型。邓苙等32研究
13、指出树鼩MPTP模型与6-OHDA模型相比，PD行为学特征更明显，树鼩的TH阳性神经细胞呈双侧性减少，提示MPTP经腹腔注射是制备树鼩PD模型的理想方法。与灵长类动物相比，啮齿动物对MPTP毒性的敏感性较低，白老鼠几乎不受MPP+的影响，MPTP限制在黑色小鼠或灵长类的PD动物模型中8.急性MPTP给药主要引起DA能神经细胞非凋亡性死亡，而长期施用低至中等剂量的神经毒素导致由凋亡性细胞死亡引起的进行性的神经变性，可以反映PD患者大脑中的细胞分子生物学变化33.2 转基因小鼠模型转基因模型主要是基于家族性PD相关基因的发现，迄今为止，已经鉴定了15个致病基因和超过25个遗传风险因子34,归类为“
14、PARK基因和“非PARK基因。已经证明-synuclein水平过表达，在病理开展中至关重要。2.1 基因敲除模型Nuytemans等35研究发现PINK1（PTEN-induced putative kinase 1,PARK6）的约30种致病突变与PD相关。然而，小鼠PINK1缺失不会导致明显的表型，迄今为止，开发的PINK1敲除（-/-）和敲低小鼠模型显示轻度的神经退行性变化36.Oliveras-Salv等37研究显示重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）2/7载体介导的雌性C57BL/6小鼠SN中PINK1的敲低不会引起行为缺
15、陷或DA细胞死亡、不增强-synuclein诱导的神经病理学变化，但是在PINK1-/-小鼠中-synuclein诱导的DA能细胞死亡和磷酸化增强。PINK1-/-小鼠SN中的DA神经元没有丧失，但纹状体中突触可塑性受损38,表型仅显示总DA水平的轻微降低39.而Glasl等40在PINK1-/- C57BL/6J小鼠中观察到DA细胞的丧失、神经变性增加，表现为PD早期病症。钙离子非依赖型磷酸酯酶A2, VIa亚型（calcium-independent phospholipase A2, group VIa,iPLA2）基因突变PLA2G6发生于PD的多种神经疾病中。Blanchard等41研究显示，雄性iPLA2-/-小鼠4个月时，神经病理学变化很小。12个月时，小鼠出现运动障碍、小脑神经元损失和纹状体中-synuclein积累。15 20个月，该模型仍未出现PD特有的运动特征，仅显示神经炎症和PD相关的神经病理学变化。Wang等42发现tetranectin基因敲除C57BL6/J小鼠（TN-/-）与年龄匹配的WT小鼠相比，12个月时，SNc中具有较少的DA神经元。DAT、二羟苯乙酸水平升高，意味着小鼠纹状体DA能终端的代偿性增加。小鼠运动缓慢、旋转速度变慢，运动功能逐渐恶化
