1、第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):55Feb.,2023 收稿日期:2021-12-28 作者简介:杜金红(1991-),女,湖北省襄阳人,学士,主治医师,研究方向:胸部肿瘤诊治,E-mail:。U1 调控乳腺癌细胞耐药性的分子机制杜金红,谭波,张丹(应城市人民医院 肿瘤血液内科,湖北 应城 432400)摘要:目的探讨糖酵解在乳腺癌细胞耐药性中的潜在关联及机制。方法筛选乳腺癌细胞 HCC1937、MCF7 顺铂抗性细胞系。三氟甲氧基羰基氰苯腙(FCCP)诱导后细胞的耗氧率(OCR)的检测表示乳腺癌细胞的糖酵解水平。miR-NA 高通量测序
2、和遗传学筛选鉴定乳腺癌耐药株中调节糖酵解和耐药性的关键分子。结果乳腺癌耐药株在将糖酵解途径重编程为有氧糖酵解。过表达 miR-485-5p 时耐药株中 FCCP 诱导的 OCR 显著上升(P 0.05)。过表达 miR-485-5p 时耐药株对顺铂的抗性减弱(P 0.05)。敲低 MICU1 时,耐药株中 FCCP 诱导的 OCR 显著上升(P 0.05),耐药株对顺铂的抗性减弱(P 0.05)。过表达 miR-485-5p 时 MICU1 的 mRNA 水平和蛋白水平均下降(P 0.05)。同时,miR-485-5p 靶向 MICU1 mRNA 的 3端非编码区。结论乳腺癌中 miR-485
3、-5p 靶向 MICU1 mR-NA 的 3端非编码区减少了 MICU1 的表达水平。MICU1 促进乳腺癌细胞的有氧糖酵解,促进了乳腺癌细胞对顺铂的抵抗作用。关键词:miR-485-5p;MICU1;乳腺癌;耐药性;糖酵解中图分类号:R730.5 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0009Molecular mechanism of miR-485-5p targeting MICU1 toregulate drug resistance in breast cancer cellsDU Jin-hong,TAN Bo,ZHANG Dan(D
4、epartment of Oncology and Hematology,Yingcheng People s Hospital,Yingcheng 432400,China)Abstract:ObjectiveTo explore the potential association and mechanism of glycolysis in drug resistance of breast cancercells.MethodScreening of breast cancer cells HCC1937 and MCF7 cisplatin-resistant cell lines.M
5、easurement of the oxygenconsumption rate(OCR)of cells after induction with trifluoromethoxycarbonyl cyanophenylhydrazone(FCCP)indicates thelevel of glycolysis in breast cancer cells.miRNA high-throughput sequencing and genetic screening identify key molecules reg-ulating glycolysis and drug resistan
6、ce in breast cancer drug-resistant strains.ResultBreast cancer-resistant strains repro-gram the glycolytic pathway to aerobic glycolysis.FCCP-induced OCR was significantly increased in drug-resistant strainswhen miR-485-5p was overexpressed(P 0.05).The resistance of drug-resistant strains to cisplat
7、in was weakened whenmiR-485-5p was overexpressed(P 0.05).FCCP-induced OCR was significantly increased in the resistant strains whenMICU1 was knocked down(P 0.05).And the resistance of drug-resistant strains to cisplatin was weakened(P 0.05).Both mRNA and protein levels of MICU1 were decreased when m
8、iR-485-5p was overexpressed(P 70%汇合时,进行胰酶消化传代,并增加顺铂的剂量。采用 Lipofectamine 3000 进行所有的瞬时转染细胞。1.2.2 RNA 抽取与实时荧光定量 PCR 检测 MICU1的 mRNA 表达水平 使用 RNeasy Plus Mini kit 进行 RNA 提取。用Reverse Transcription Kit 使用等体积的随机引物、ol-igo dT 以及 2 g RNA 进行逆转录。定量实时 RT-PCR 分析在 10 L 反应体积中进行,包括 1 L cD-NA 模板(稀释 20 倍)、SYBR Green Mas
9、ter Mix 和下列引物。比较 Ct 方法用于计算 mRNA 的相对丰度并与 GAPDH 的相对丰度进行比较。MICU1-F:5-GAGGCAGCTCAAGAAGCACT-3;MICU1-R:5-CAAACACCACATCACACACG-3;GAPDH-F:5-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3;GAPDH-R:5-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3。1.2.3 免疫印迹检测 MICU1 的蛋白表达水平在补充有蛋白酶-磷酸酶混合物的 RIPA 缓冲液中对细胞裂解物进行免疫印迹分析。简而言之,细胞裂解物在 10%或 12%三甘氨酸 SDS-PAGE 凝胶上分离并转移到
10、PVDF 膜上。膜在含0.1%Tween-20 的 TBS、5%脱脂奶粉中于室温下封闭1 h,然后在含 5%BSA 的 TBST 中与指定的一抗(MICU1 抗体稀释倍数:11 000,ACTIN 抗体稀释倍数:1 5 000)孵育过夜。随后用 TBST 洗 3 次并使用二抗(稀释倍数:110 000)室温下孵育 1 h。孵育完成后,TBST洗 3 次并使用化学发光仪进行条带分析。使用 AC-TIN 作为内参。1.2.4 miRNA 高通量测序使用 Illumina HiSeq 2500 进行高通量测序,然后构建 DNA 文库。为了构建 DNA 文库,首先使用Trizol 试剂分离乳腺癌耐药株
11、与非耐药株的总RNA。然后,通过凝胶电泳分离大小为 18 30 nt 的RNA 分子,并将 3和 5接头连接到 RNA。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)构建连接产物,并富集140 160 bp 的 PCR 产物以生成 cDNA 文库。测序后,过滤背景 reads 数后使用 miRBase 版本 21(ht-tp:/www.mirbase.org)、Rfam12.1(http:/rfam.xfam.org)和 piRNAbank(http:/pirnabank.ibab)与小 RNA对齐来识别已知的 miRNA。对于新的miRNA 候选预测,使用 Mireap v0.2 软件应用以下选择标
12、准:去除异构体、发夹结构、结合自由能小于-20 kcal/mol 的稳定二级结构,以及位于基因间间隔区。1.2.5乳腺癌非耐药株与耐药株细胞耗氧率的测定 使用 96 孔 XF 分析仪和 XF 细胞线粒体应激试剂盒测量线粒体呼吸的不同参数。测定前 12 h,将XF 传感器小柱与所提供的校准物水合,并在 37 65 1 期杜金红,等:U1 调控乳腺癌细胞耐药性的分子机制下无 CO2孵育(pH 值7.4)。制备未缓冲的 XF 测定培养基,将相应处理的乳腺癌非耐药株或耐药株细胞从60 孔培养皿重新接种到96 孔 XF 测定板,细胞密度为每孔 3 104个细胞。在测定前 30 min,用测定培养基洗涤板
13、并在 37下无 CO2温育。将 FCCP(500 nmol/L)加入墨盒的适当端口中,并在仪器中进行校准。试剂盒校准后,将细胞培养板装入仪器中,按照标准模板运行测定并测量 OCR。1.2.6 乳腺癌非耐药株与耐药株乳酸水平的测定用乳酸测定试剂盒测定乳酸浓度。将 5 105细胞接种在 35 mm 的平板中生长 48 h,然后在乳酸测定缓冲液中裂解。将 5 10 L 的裂解物等试样分布在适用于吸光度测量的 96 孔板中。由测定缓冲液、底物和显色剂组成的反应混合物加入到每个孔中。通过酶促测定确定乳酸浓度,其产生与乳酸浓度成比例的比色(570 nmol/L)产物。1.2.7 乳腺癌非耐药株与耐药株细胞
14、活力水平的测定 收集处理后的乳腺癌非耐药株或耐药株细胞,计数并接种在 96 孔板(每孔 2.5 10 个细胞)中,培养 24 h。使用 CyQUANT NF Cell Proliferation AssayKit 测定细胞增殖,并在 485 nmol/L 激发、530 nmol/L 发射检测下测量荧光强度。每次重复实验至少 3次,一式三份。1.2.8荧光素酶报告实验检测 miR-485-5p 于MICU1 mRNA 3-非翻译区(3UTR)的相互作用 野生型 MICU1 mRNA 3-非翻译区(3UTR)和突变型 MICU1 mRNA 3-非翻译区(3UTR)克隆到pmirGLO 载体中以分别
15、生成 pmirGLO-MICU1-3UTR-WT 和 mirGLO-MICU1-3UTR-MT 构建体。在与 1 g 报告质粒和 1 g pmirGLO 内部对照质粒共转染之前,将 MCF7 细胞接种到 24 孔板(6.0104个细胞/孔)上 24 h。8 h 后,更换培养基并用100 nmol/L miR-485-5p mimics 或对照(DMSO)转染细胞。孵育 48 h 后,裂解转染的细胞并使用双荧光素酶报告基因检测系统检测其荧光素酶活性。萤火虫萤光素酶活性被归一化为海肾萤光素酶的活性,每组检测一式三份。1.3 统计学分析用 SPSS 软件进行统计分析。定量数据表示为平均值 标准偏差。
16、使用单向方差分析(ANOVA)、最小显著差异事后检验和 t 检验来比较均值,P 0.05具有统计学意义。2 结果与分析2.1 乳腺癌非耐药株与耐药株的糖酵解水平为了研究人乳腺癌细胞中顺铂抗性的机制,筛选出乳腺癌细胞 HCC1937 和 MCF7 抗性细胞系(HCC1937/CR 和 MCF7/CR 细 胞)。为 了 测 试HCC1937/CR 和 MCF7/CR 细胞以及亲代细胞的抗性,将这些细胞暴露于顺铂。顺铂处理可以显著抑制亲本细胞的增殖(0.11 0.01 vs 0.58 0.07,0.11 0.01 vs 0.62 0.07,P 0.05),但不能抑制抗性细胞,见图 1A-B。细胞的耗氧率(OCR)被测量为线粒体电子传递的指标并且 OCR 与有氧糖酵解呈 负 相 关。与 对 照 细 胞 相 比,MCF7/CR 与HCC1937/CR 中显著降低了三氟甲氧基羰基氰苯腙(FCCP)诱导的耗氧量(77 11 vs 45 5,77 11 vs51 4,77 11 vs 33 3,P 0.05)。表明乳腺癌耐药株在将糖酵解途径重编程为有氧糖酵解,见图1C。此外,MCF7/CR 与 HCC
