1、论 著链 突变致异常纤维蛋白原血症家族的纤维蛋白原功能分析毕美霞，郑雪玲，李北，岳晓静，高润光 焦作市中医院检验科 实验室，焦作；焦作市妇幼保健院 实验室，焦作 摘 要：目的 分析一个由 链 突变引起、患病成员症状有差异的遗传性异常纤维蛋白原血症家族的纤维蛋白原（，）功能。方法 收集该遗传性异常纤维蛋白原血症家族患者外周血样本，常规凝血功能试验筛查家族成员凝血功能；法筛查 基因（、）突变位点，法验证以确认突变；生物信息软件预测突变 功能；血栓弹力图（）和功能性 试验对家族所有患病者进行 凝聚功能评价；动态凝聚试验和纤维蛋白溶解试验检测患病成员纤维蛋白聚集和溶解功能。结果该家族共有突变基因携带者
2、 名，常规凝血实验和基因突变检测均符合异常纤维蛋白原血症的诊断；名突变基因携带者经 法验证为同一突变位点；和 等预测软件均表明该突变为影响纤维蛋白原聚合的有害突变；家族突变基因携带者中 名有症状者 相关参数与无症状者相比明显变化，凝集试验显示该 名有症状者凝固曲线起峰时间明显延长且峰值降低；纤维蛋白溶解试验表明家系中多数（）突变基因携带者纤维蛋白在限定时间中不能完全溶解。结论 链 突变的异常纤维蛋白原血症患者症状可有差异，应全面分析该突变引起的异常纤维蛋白血症家系的基因型和表型，并长期观察患者纤维蛋白功能和凝血功能的变化。关键词：遗传性异常纤维蛋白原血症；突变；纤维蛋白原；血栓弹力图中图分类号
3、 文献标识码 文章编号（）：基金项目：河南省焦作市科技局科技计划项目（）通信作者：高润光，：:,;,:,(,),;();,();血栓与止血学 年第 卷第 期 ;()(),:;遗 传 性 异 常 纤 维 蛋 白 原 血 症（，）是纤维蛋白原（，）结构和功能异常的常染色体显性或共显性遗传病。是在肝脏合成的二聚体糖蛋白，编码 的三个基因（、）发生突变是该病的主要病因。据人类基因突变数据库（，）统计，的主要突变形式有错义、插入、缺失等，且上述变异可发生在外显子的任何部位，至今发现的病例以、基因突变多见。常规凝血检查、病史、家族史和基因检测是诊断该病的重要手段。目前研究多集中在突变位点和纤维蛋白原功能，
4、进而确定基因型和表型的对应关系，而家族中不同患者间纤维蛋白原功能差异的比较未见报道。本课题组在之前报道的一个 家族的基础上，后续跟踪随访中发现 名突变基因携带者的症状有差异，且先前无症状者后期随访时出现了出血症状。本研究主要探讨患病家族中患者纤维蛋白原功能变化与临床症状间的关系，为更深刻理解 患者的病程提供实验依据。资料与方法 家系资料本 家系先证者，女，岁，无血栓和出血病史，来院要求“经阴道分娩”，常规凝血检查发现 活性浓度（参考范围 ）明显减低，凝血酶时间（，）显著延长（参考范围 ），临床观察并无症状，分娩顺利。经家系调查和基因检测诊断为 家族（，）。家族共 人，有基因突变携带者 人，均检
5、测到同一位点突变。本研究取得患者及家属知情同意并经医院伦理委员会批准（备案号：）。样本采集采集患者的常规凝血样本，新鲜静脉血和枸橼酸钠抗凝剂（）比例为 ，离心，取血浆，内完成常规凝血检验，不能完成检测的样本存于 分装保存，检测前 水浴快速溶解复温。样本均符合全自动凝血仪上机检测的要求且样本红细胞比容均。用于基因检测的样本为 抗凝血。本研究常规凝血和 活性和抗原检测均用希森美康 及配套试剂。基因分析抽提患者外周血（天隆 全自动核酸提取仪）。采用 技术对、基因外显子及剪切位点区域进行（公司 平台）测序，基因覆盖度为，平均测序深度为，低质量区用 测序法补充。参比序列为：。生物信息软件分析、和 等生物
6、信息学软件预测该突变对蛋白质功能的影响。血栓弹力图检测（）按照血栓弹力图凝血分析仪（美国 产品）标准操作规程检测家系成员 相关参数：凝血反应时间（）、血凝块形成时间（）、凝固角（）、最大振幅（）、纤维蛋白溶解率（）、综合凝血指数（）。纤维蛋白原动态凝固曲线分析用 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液血栓与止血学 年第 卷第 期 （、）调血浆 浓度至 ，孔反应板内加 血浆和 人凝血酶（，公司）。微孔板分光光度计 连续监测至纤维蛋白原凝固，读数间隔时间为 。纤维蛋白溶解曲线分析 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（）调血浆 浓度至 ，加人凝血酶、纤溶酶原和人尿激酶型纤溶酶原激活物，使浓度分别为 、。混匀后加（浓度至 ）
7、。微孔板分光光度计 连续监测，计数一次，连续。统计学处理采用 软件处理数据，计量数据以（?）表示，正态性和方差齐性分别以 和 检验，有症状和无症状突变基因携带者间比较以独立样本的 检验，为差异有统计学意义。结果 异常纤维蛋白原血症家族患病成员临床资料在先前研究工作的基础上，本研究进一步完善了家系信息。此家族携带突变基因者达 名，常规凝血和基因突变检测均符合 的诊断标准，而其中 名患者有出血症状，其他患者没有明显异常。家系遗传图见图。患病家族成员临床基本资料见表。12123 4 5345667897891 01 11 212121 0注：箭头所指为先证者图 异常纤维蛋白血症家族的家系图表 家系患
8、病成员基本资料成员性别年龄（岁）症状 （活性）（）（抗原）（）男鼻衄、伤口延迟愈合男皮肤瘀斑女鼻衄、皮肤瘀斑男牙龈出血、皮肤瘀斑男眼底出血、皮肤瘀斑男无女无男无女无女无男无注：为先证者；：凝血酶时间；（活性）：法；（抗原）：免疫比浊法 基因突变位点检测先证者以 法检测到 基因第二外显子可疑 突 变，测 序 法 确 认 该 突 变 为，其父在同一位点检测到相同突变。家族其他患病成员均检测到相同突变，家系调查并绘制家系遗传图后，确认该异常纤维蛋白血症家族，基因测序峰图见图（此图为反向序列）。生物信息软件预测经、和 等生物信息学软件预测该突变位点位于纤维蛋白原 链与 链聚合区域，该位点突变导致的氨基
9、酸改变（）可影响纤维蛋白原的聚合，为有害突变。血栓与止血学 年第 卷第 期 ABCF G Ac.1 0 6 G A(R e v e r s e d i r e c t i o n)F G Ac.1 0 6 G A(R e v e r s e d i r e c t i o n)1 0 6注：先证者的测序峰图（反向）；先证者父亲的测序峰图（反向）；参比序列（）图 异常纤维蛋白原血症家族先证者基因测序峰图 血栓弹力图检测家系患病成员血栓弹力图相关参数：凝血反应时间（）、血凝块形成时间（）、凝固角（）、最大振幅（）、纤维蛋白溶解率（）、综合凝血指数（），有出血症状患者的、分别为：（）、（）、（），无
10、症状者的、值分别为：（）、（）、（）。有出血症状者与无症状者相比、增大（），减小（），差异有统计学意义。提示有症状患者功能性纤维蛋白原降低。见表。表 异纤家族患者 相关参数成员（）（）（）（）（）（）注：为家族中有症状者，其余无症状。纤维蛋白原动态凝固曲线与正常人混合血浆相比，家族所有患者的凝固曲线的凝固开始时间均延迟，最大凝固率降低。与正常人和无症状患者相比，五名有症状者凝固曲线变化更明显，提示有症状者 凝固功能下降更加明显，见图。0.20.1 80.1 60.1 40.1 20.10.0 80.0 60.0 40.0 201 0 0 01 5 0 02 0 0 05 0 00正常混合血浆5
11、9135793吸光度A 3 6 5 N M时间（s）注：、为家族中有症状者，其余无症状图 家系成员纤维蛋白原动态凝固曲线图 纤维蛋白溶解曲线与正常人混合血浆相比，家族所有突变基因携带者的 溶解曲线的溶解开始时间均延迟，最大溶解率也低于正常混合血浆，有症状者和无症状者无明显差别，见图。1 0 0 01 5 0 02 0 0 05 0 00时间（s）0.4 50.40.3 50.30.2 50.20.1 50.10.0 50吸光度A 3 5 0 N M正常混合血浆35793591注：、为家族中有症状者，其余无症状图 家系成员纤维蛋白溶解曲线图血栓与止血学 年第 卷第 期 讨论 此异常纤维蛋白原血症
12、家系是本课题组发现并报道，完成了该家系所有成员的基因检测，基因型和表型鉴定均相符。虽然已有文献报道了这个突变（，），但是其仅为单个病例，没有给出家系分析。本研究收集了家系成员的病史和临床资料，发现该家族患病成员间临床症状有差异，并对家族患病成员进行纤维蛋白原功能分析。异常纤维蛋白原血症表现为 活性和 抗原不同程度的降低，可分为、两种类型，型可能的致病机制是突变影响了 的合成、装配、胞内成熟过程及各结构域的稳定性。型可能为编码 蛋白的三个基因突变而致其功能改变，包括、释放延迟或障碍，单体聚合能力延迟或增强，交联缺陷，凝血酶或纤溶酶作用位点构像改变。本家族可能为型。编码纤维蛋白原的三个基因均可发生
13、突变导致，据突变位置的不同，纤维蛋白原的结构异常而致的功能异常也不同。近 的 患者并无症状，有症状的 患者可以是出血或者血栓。有研究发现 患者的症状并不稳定，应长期观察，异纤症状的异质性与病人本身的临床状态有关。本研究的突变位点（，）所在区域与凝血酶切割位点相邻且为凝血酶切割后 链与 链聚合区域，预测软件显示该位点在脊椎动物中高度保守，突变可能影响凝血酶切割和蛋白聚合，患病成员纤维蛋白原动态凝固试验和纤维蛋白溶解试验均证实了蛋白结构预测软件的结果。有症状者纤维蛋白原动态凝固曲线明显延迟且固定时间内 未完全溶解，纤维蛋白原动态凝固试验和纤维蛋白溶解试验是否可以作为患者出血和血栓倾向的预测实验仍需
14、大样本实验验证。该家族中年轻患者无症状，女性先证者孕期和经阴道分娩也无出血增多或其他凝血功能异常，而家族中年长者（、）和个别年轻携带者（）有出血症状。有症状者与无症状携带者的 试验、纤维蛋白原聚集试验和纤维蛋白溶解试验相关参数比较有明显变化。年轻携带者血浆是否有更多聚集功能正常的？年龄是否为该家族异纤患者症状变化的原因？这些仍需进一步研究。血栓弹力图检测评估携带者 功能中，有出血症状患者与无症状者相比 值、值增大，值减小。其中 值特异性反映血浆功能性 含量，家族突变基因携带者有症状和无症状者相比 变化比 值、值变化更明显，提示其对于异纤患者更敏感，可以更好评估 功能，但其是否可以作为常规筛查仍
15、需实验验证。鉴于本病发病率低的特点，虽有热点突变，更多的病例为其他位点的突变且家族患病者数量不能确定（通常较少），无法给出统计描述。只能在了解各片段 功能的前提下，估计该突变对 功能的影响，然后观察体外实验和病人症状间的关系。患者为研究纤维蛋白原基因和蛋白功能提供了天然的样本库，尤其应关注为同一突变位点的 家族，分析不同个体间纤维蛋白原功能的差异。本例中家族突变基因携带者达 人且症状有异质性，应长期随访，分析引起症状变化的原因，为 基因型和表型关系研究提供数据。蛋白功能预测软件虽可提供有益数据和参考，但突变导致的蛋白质功能变化复杂，应有充分实验验证，例如蛋白质建模分析，扫描电镜等。综上所述，临
16、床发现的异常纤维蛋白原血症患者不仅应给出突变位点诊断，更应结合症状分析纤维蛋白原结构和功能，分类处理。本突变家族突变基因携带者达 人，且症状在家族中依年龄差别有变化，就目前可查阅文献，为首次报道。未来可能发现更多异纤家族，应做家系分析，长期观察不同成员在不同状态下的纤维蛋白原功能变化，为更深刻理解纤维蛋白原凝固过程和出凝血机制提供依据。作者贡献声明 毕美霞负责研究思路、实验计划和论文撰写；郑雪玲、李北、岳晓静负责实验实施和数据收集；高润光负责数据处理利益冲突 所有作者均声明无利益冲突参考文献，：，（）：，：，（）：，：，（）：，血栓与止血学 年第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：周景 艺，王 学 锋，丁 秋 兰，等 纤 维 蛋 白 原 链 突变所致异常纤维蛋白原的功能研究中华血液学杂志，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：钱婷婷、张洪亮）读者作者编者血栓与止血学 年杂志调价和征订 血栓与止血学杂志由钟南山院士与刘泽霖教授任名誉主编、杨仁池教授任主编、广州医科大学主办、血栓与止
