1、解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1【摘要】目的探讨转录因子 ZXDC 基因敲减对脊髓神经元（SCNs）氧化应激损伤后的保护作用及机制。方法应用不同浓度H2O2诱导SCNs氧化应激损伤，CCK8检测细胞活性筛选H2O2诱导最佳浓度；实验细胞分为：Control组、H2O2+AAVNC组和H2O2+AAVZXDC siRNA组，免疫荧光染色鉴定原代SCNs，检测各组ZXDC 表达和神经突起平均长度；Western bolt 检测各组细胞中 ZXDC、CCL2、CCR2 表达，qRTPCR 检测细胞中炎症因子 TNF 和 IL1 mRNA 表达，应用
2、 EdU 荧光染色、CCK8 检测 ZXDC 对 SCNs 增殖和活性的影响。结果筛选600 mol/L H2O2适用于SCNs氧化应激模型制备。tubulin免疫荧光染色鉴定原代SCNs培养成功；与 Control 组比较，H2O2+AAVNC 组神经突起平均长度显著降低，ZXDC、CCL2 和 CCR2 表达显著增高，而H2O2+AAVZXDC siRNA 组较H2O2+AAVNC组神经突起平均长度显著增高，ZXDC、CCL2和CCR2蛋白表达显著降低（P0.05）；与Control 组比较，H2O2诱导组TNF和IL1 mRNA 相对表达显著增高，细胞增殖和细胞活力显著降低。与H2O2+
3、AAVNC组比较，H2O2+AAVZXDC siRNA 组TNF和IL1 mRNA相对表达显著降低，细胞增殖和细胞活力显著增高（P0.05）。结论ZXDC 基因敲减通过调控CCL2/CCR2信号通路促进氧化应激损伤SCNs细胞增殖、细胞活力和神经突生长。【关键词】脊髓神经元；锌指X连锁重复家族成员C；脊髓损伤；增殖；氧化应激损伤基金项目：国家自然科学基金（81870977）；黑龙江省自然科学基金（JQ2021H004）；黑龙江省属高校基本科研业务费项目（2021KYYWF0469）；牡丹江医学院科学基金火炬计划项目（2022MYHJ012）；牡丹江医学院研究生导师科研专项计划项目（YJSZX2
4、022007）DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.01Effect of ZXDC knockdown on spinal cord neurons after oxidative stress injuryLV Zhongxiao，LI Wenyuan，Yan Min，WANG Xiaoyu，Liu Dongming，YU Jing，WANG YingInstitute of Neural tissue Engineering，Mudanjiang Medical University，General Surgery Department of Mudanjia
5、ngFirst Peoples Hospital，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，ChinaCorrespondent author，WANG Ying，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of transcription factor ZXDCknockdown on spinal cord neurons（SCNs）after oxidative stress injury.MethodsDifferent concentrations of H
6、2O2were implemented to induce oxidative stress injury in SCNs，and the optimal concentration of H2O2induction wasscreened by CCK8 assay.The cells were divided into：Control group，H2O2+AAVNC group and H2O2+AAVZXDCsiRNA group，and the primary SCNs were identified by immunofluorescence staining.The ZXDC e
7、xpression and neurite length were detected by immunofluorescence staining.The expression of ZXDC，CCL2 and CCR2 in each groupwere evaluated by using Western Blot，the expression of inflammatory factors TNF and IL1 mRNA in cells wasquantified by fluorescence realtime quantitative polymerase chain react
8、ion（qRTPCR），and EdU fluorescencestaining and CCK8 were applied to detect the proliferation and activity of SCNs.ResultsScreening of 600 mol/LH2O2was suitable for the preparation of SCNs oxidative stress model.IIItubulin immunofluorescence staining wassuccessful in identifying primary SCNs in culture
9、.Compared with the Control group，the average neurite length wassignificantly decreased，and the expression of ZXDC，CCL2 and CCR2 was significantly increased in the H2O2+AAV论著ZXDC 基因敲减对脊髓神经元氧化应激损伤的保护作用吕忠孝，李文媛，闫敏，王晓宇，刘东明，喻静，王莹牡丹江医学院神经组织工程研究所，牡丹江市第一人民医院普外科，黑龙江 牡丹江157011通讯作者：王莹，Email：1解剖学研究2023年第45卷第1期An
10、at Res,2023,Vol.45,No.1NC group.Moreover，the H2O2+AAVZXDC siRNA group increased average neurite length and decreased the expression of ZXDC，CCL2 and CCR2 compared with the H2O2+AAVNC group（P0.05）.Compared with the Controlgroup，the H2O2induced group significantly increased the expression of TNF and I
11、L1 mRNA and decreased cellproliferation and cell viability，and the H2O2+AAVZXDC siRNA group decreased the expression of TNF and IL1 mRNA and increased cell proliferation and viability than those of the H2O2+AAVNC group（P0.05）.ConclusionZXDC knockdown promotes cell proliferation，cell viability and ne
12、urite growth in oxidative stressinjuredSCNs through regulating the CCL2/CCR2 signaling pathway.【Key words】Spinal cord neurons；Zinc finger Xlinked duplicated family member C（ZXDC）；Spinalcord injury；Proliferation；Oxidative stressinjured全球每年有 50 万人遭受创伤性脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI），导致运动或感觉功能损伤。由于神经元凋亡、损
13、伤部位胶质细胞和巨噬细胞浸润、原发性损伤后炎症以及中枢神经系统复杂的继发性损伤，SCI患者临床治疗效果受到严重限制1，2。一旦发生SCI，血脊屏障破坏，脊髓神经元（Spinal cord neurons，SCNs）遭受氧化应激损伤，发生细胞坏死和凋亡，伴有大量炎性细胞趋化聚集，造成进一步 SCI 损伤3。因此，降低炎症因子趋化聚集并重建有利于神经元再生微环境是SCI治疗的一个极具前景的策略。锌指X连锁重复转录因子家族与调节抗原呈递细胞中主要组织相容性复合物 II 类基因（Majorhistocompatibility complex II，MHC II）的转录有关，其他功能尚不清楚4。研究表明
14、骨髓细胞分化与炎症反应中，锌指 X 连锁重复家族成员 C（Zincfinger Xlinked duplicated family member C，ZXDC）与炎症趋化因子CC基序趋化因子配体2（CC motif ligand 2，CCL2）启动子相互作用，上调 CCL2 表达，促进炎症因子TNF和IL6分泌5。然而ZXDC对SCNs 氧化应激损伤的作用尚不明确。本研究拟应用AAVZXDC siRNA 转染培养的氧化应激损伤SCNs模型，探讨ZXDC基因敲减通过CCL2信号通路对氧化应激损伤 SCNs 保护作用。为促进脊髓损伤神经再生治疗提供新型基因治疗靶点。1材料与方法1.1材料1.1.1
15、主要试剂AAVNC 和 AAVZXDC siRNA腺相关病毒（美国Vector Biolabs），兔源性ZXDC抗体、鼠源性 tubulin 抗体、兔源性 CCL2 抗体、兔源性CCR2抗体、GAPDH抗体、FITC标记羊抗兔二抗、TRITC 标记羊抗鼠二抗（美国 Thermo FisherScientific），EdU DNA 细胞增殖试剂盒（美国 Ribobio）、CCK8 试剂盒（北京 Solarbio 科技）、胎牛血清（美国 Gibco）、DMEM 培养基（美国 Hyclone），胰蛋白酶、BCA蛋白质定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒（美国 Sigma）；引物设计由中国 Takara
16、公司完成，荧光显微镜（德国Leica）、酶标仪（美国ThermoFisher Scientific），等。1.1.2研究对象新生SD大鼠，4日龄，平均体质量 9.3 g，购自中国医科大学实验动物中心（认证号：SCXK Liao 20030009）。1.2实验方法1.2.1SCNs 原代培养取 4 只新生 SD 大鼠按前期研究方法6，应用浓度为 2%戊巴比妥钠麻醉（40 mg/kg），CO2处死。在无菌条件下分离脊髓，将脊髓切成 1 mm3颗粒，0.25%胰蛋白酶消化 20 min，以 1000 r/min 速度离心 5 min。弃上清液后将样品重新悬浮在 DMEM 培养基（含 20%的胎牛血清），接种在 6 孔板中（接种密度为 1.5105个细胞/孔）。为提高 SCNs 纯度，加入阿糖胞苷培养3 d（终浓度为3 mol/L）。然后置于37、5%CO2培养箱继续常规培养用于后续实验。1.2.2H2O2诱导和细胞分组取原代培养SCNs接种在 6 孔板中（1.5105个细胞/孔），每孔加入H2O2（H2O2终浓度分别为 0、200、400、600 和 800 mol/Lol/L），置于37、
