1、 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 443 LC-PDA 测定槟榔、焦槟榔、大腹皮中 4 种生物碱的含量 侯倩煜，符礼顺，梁焕宴，周亚奎，杨新全，赵祥升*(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，海口 570311)摘要：目的 建立槟榔、焦槟榔、大腹皮中槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱含量的 LC-PDA 测定方法。方法 样品加氨水浸润，甲醇超声提取。ZORBAX 300-SCX 色谱柱(150 mm4.6 mm，
2、5 m)分离，流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.2%甲酸水(氨水调节 pH=3.8)，梯度洗脱，流速为 0.5 mLmin1，柱温为 30，进样量为 5 L，检测波长为225 nm。结果 槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱分别在 2.98745.0，2.60650.0，1.19595.0，1.22610.0 gmL1内与峰面积呈良好的线性关系(r2 0.999 0)。槟榔、焦槟榔、大腹皮中槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱的平均加样回收率(n=6)均在95.0%105.0%，RSD0.999 0).The average recoveries of arecoline,a
3、recaidine,guvacoline and guvacine in Arecae Semen,Arecae Semen Tostum and Arecae Pericarpium were ranged from 95.0%to 105.0%,with RSD98%；槟榔次碱(成都克洛玛生物科技有限公司，批号：CHB180305；纯度98%)，色谱纯甲醇、乙腈、甲酸、氨水购自 Fisher 公司，水为屈臣氏蒸馏水。2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX 300-SCX(150 mm4.6 mm，5 m)；流动相：乙腈(A)-0.2%甲酸水(氨水调节pH=3.8)(B)，梯
4、度洗脱(010 min，3%A；1011 min，表 1 样品信息 Tab.1 Sample information 样品No.批号 产地 样品 No.批号 产地槟榔S1BL202111HN01 海南焦 槟 榔 S24 JBL202111HN03 海南S2BL202111HN02 海南S25 JBL202111HN04 海南S3BL202111HN03 海南S26 JBL202111HN05 海南S4BL202111HN04 海南S27 JBL202111HN06 海南S5BL202111HN05 海南S28 JBL202111GX07 广西S6BL202111HN06 海南S29 JBL20
5、2111GX08 广西S7BL202111HN07 海南S30 JBL202111GX09 广西S8BL202111HN08 海南S31 JBL202111GD10 广东S9BL202111HN09 海南S32 JBL202111GD11 广东S10 BL202111HN10 海南S33 JBL202111YN12 云南S11 BL202111HN11 海南S34 JBL202111YN13 云南S12 BL202111HN12 海南大 腹 皮 S35 DFP202111HN01 海南S13 GL202111GX13 广西S36 DFP202111HN02 海南S14 GL202111GX14
6、 广西S37 DFP202111HN03 海南S15 GL202111GX15 广西S38 DFP202111HN04 海南S16 GL202111GD16 广东S39 DFP202111HN05 海南S17 GL202111YN17 云南S40 DFP202111HN06 海南S18 GL202111YN18 云南S41 DFP202111GX07 广西S19 GL202111YN19 云南S42 DFP202111GX08 广西S20 GL202111YN20 云南S43 DFP202111GD09 广东S21 GL202111YN21 云南S44 DFP202111GD10 广东焦槟榔S
7、22 JBL202111HN01 海南S45 DFP202111YN11 云南S23 JBL202111HN02 海南S46 DFP202111YN12 云南 3%45%A；1135 min，45%A)；流速：0.5 mL min1；柱温：30；进样量：5 L；检测波长：225 nm。2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品储备液 精密称取各对照品适量，置于 10.0 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配成槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱质量浓度分别为 745，650，595 和610 gmL1的混合对照品储备液，4 保存，备用。不同浓度的混合对照品溶液由储备液稀释得到。2.
8、2.2 供试品溶液 称取槟榔、焦槟榔、大腹皮药材粉末(过 5 号筛)约 1.0 g，加氨水 2 mL 浸润30 min 后，精密加入甲醇 20 mL，称重，超声提取 30 min(功率 500 W，频率 40 kHz，室温)，冷却至室温，用甲醇补足减失质量，7 155g 离心10 min，取上清液 10 mL，真空浓缩至近干，甲醇溶解残渣，定容至 5 mL，过 0.22 m 微孔滤膜，即得。2.2.3 色谱图 取“2.2.1”和“2.2.2”项下制备的混合对照品溶液和供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图 1。中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chi
9、n J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 445 图 1 LC-PDA 色谱图 A混合对照品；B槟榔样品(S15)；C焦槟榔样品(S27)；D大腹皮样品(S41)；1去甲槟榔次碱；2槟榔次碱；3去甲槟榔碱；4槟榔碱。Fig.1 LC-PDA chromatograms Amixed reference substance;Bsample of Arecae Semen(S15);Csample of Arecae Semen Tostum(S27);Dsample of Arecae Pericarpium(S41);1guvacine;2are
10、caidine;3guvacoline;4arecoline.2.3 提取方法的优化 实验中以槟榔(S10)为样品考察了影响超声提取的主要因素：氨水的加入量(0，0.5，1.0，2.0和 3.0 mL)，提取溶剂体积(10，20，30 和 40 mL甲醇)，超声时间(15，30，45 和 60 min)，结果见图2。加入氨水可以显著提高槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和去甲槟榔次碱的提取率，当氨水加入量2 mL 时，提取率没有显著增加。当甲醇体积 20 mL 和提取时间30 min 时，4 种生物碱的含量没有显著的增加。因此，槟榔样品提取条件为槟榔样品 1.0 g，2 mL 氨水浸润后，加入 20
11、 mL 甲醇超声提取 30 min。2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱的混合对照品储备液 0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0 mL，用甲醇定容至 5 mL 量瓶中，混匀，按“2.1”项下色谱条件测定。以对照品的峰面积(Y)及对应物质的质量浓度(X，gmL1)进行线性回归，目标物在各自的质量浓度范围内呈良好的线性关系(r20.999)。以信噪比为 3 时的质量浓度为检测限(limit of detection，LOD)，信噪比为 10 时 图 2 提取时间(A)、提取溶剂体积(B)和氨水体积(C)
12、对目标物提取率的影响 Fig.2 Effects of extraction time(A),extraction solvent volume(B)and ammonia volume(C)on extraction efficiency 的质量浓度为定量限(limit of quantitation，LOQ)，结果见表 2。2.4.2 仪器精密度和稳定性试验 取同一份混合对照品溶液，连续进样 6 次，记录分析物峰面积，计算其 RSD，结果槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱色谱峰峰面积的 RSD 分别为0.78%，0.45%，0.95%，1.86%，表明仪器精密度良好。取槟榔供试品溶
13、液(S10)分别于 0，2，4，8，表 2 4 个成分的线性方程、线性范围、定量限和检测限 Tab.2 Linear equation,linear range,LOQ and LOD of four constituents 成分 线性方程 r2 线性范围/gmL1 LOQ/gmL1 LOD/gmL1 槟榔碱 Y=2.28103X+4.86104 0.999 9 2.98745.0 2.98 1.49 槟榔次碱 Y=1.46103X+7.71104 0.999 8 2.60650.0 2.60 1.30 去甲槟榔碱 Y=2.66104X+4.87104 0.999 7 1.19595.0 1
14、.19 0.60 去甲槟榔次碱 Y=1.90104X+3.38104 0.999 9 1.22610.0 1.22 0.61 446 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 12，18，24 h 时间点进样，计算分析物峰面积的RSD，结果槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱色谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.08%，0.95%，1.24%，1.94%，表明溶液中被测成分在24 h 内稳定性良好。2.4.3 重复性试验 按照“2.2.2”项下方法制备槟榔(S10)、焦槟榔(
15、S24)、大腹皮(S38)的供试品溶液各 6 份，分别进样检测。结果槟榔及其炮制品中槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱含量的 RSD 在 0.50%2.50%，表明该方法重复性良好。2.4.4 加样回收率试验 分别称取 6 份已知含量的槟榔(S10)、焦槟榔(S24)、大腹皮(S38)样品0.50 g，精密加入适当浓度的对照品溶液(相当于供试药材原有含量质量分数的 100%)。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表 3。由表 3 可知，槟榔、焦槟榔和大腹皮中 4 种成分的平均加样回收率在96.9%104.5%，RSD均3.0%
16、，表明方法准确可靠。表 3 加样回收实验结果 Tab.3 Results of recovery test%成分 槟榔 焦槟榔 大腹皮 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率RSD去甲槟榔次碱 104.5 0.63 98.1 0.87 103.01.29 槟榔次碱 100.6 1.54 99.6 1.45 103.60.63 去甲槟榔碱 96.9 0.80 99.3 1.15 98.52.01 槟榔碱 102.8 0.97 102.9 1.09 101.50.61 2.5 样品测定 分别称取不同产地的槟榔、焦槟榔、大腹皮药材粉末 1.0 g，按“2.2.2”项下超声提取方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定(n=3)，计算槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱的含量，结果见表 46。由表可知，槟榔中槟榔碱(2.217.41 mgg1)含量较高，其次为去甲槟榔次碱(1.003.42 mgg1)、槟榔次碱(0.471.81 mgg1)和 去 甲 槟 榔 碱(0.57 1.79 mgg1)含量较低。焦槟榔中槟榔碱(1.04 4.42 mgg1)含 量 较 高，去 甲 槟 榔
