1、吉林农业大学学报 2023，45（1）：101-115http:/Email:jlndxb Journal of Jilin Agricultural University1株多重耐药大肠杆菌噬菌体的分离、鉴定、生物学特性及全基因组分析*魏炳栋1，2，3，丛聪4，于维1，3，徐永平2，4*，李纪彬2，李淑英21.吉林省农业科学院畜牧分院，公主岭 136100；2.大连赛姆生物工程技术有限公司，大连 116620；3.吉林省吉嘉饲料添加剂有限公司，公主岭 136100；4.大连理工大学生物工程学院，大连 116024摘 要：以多重耐药大肠杆菌F2为宿主菌，从养殖场污水中分离出1 株肌尾裂解性噬菌
2、体vB_EcoM_F2。该噬菌体可侵染多株大肠杆菌，一般生物学特性分析表明最佳感染复数为1，潜伏期30 min，爆发期90 min，爆发量为101 PFU/cell；对氯仿不敏感，可在4050、pH 4.010.0的条件下保持较高活性；全基因组测序结果表明其基因组长为168 241 bp，（G+C）%含量为37.32%，含263个开放阅读框，其中113个为已知功能编码序列，含有2个tRNA；不含溶源基因、毒力因子和抗生素耐药基因；全基因组及终末端酶大亚基系统发育树的同源性分析表明，该大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_F2与志贺菌噬菌phi25-307亲缘关系较近，但它不能侵染志贺菌属的标准菌株。目
3、前，国际病毒分类委员会（ICTV）及美国国家生物技术信息中心资源（NCBI）已将其归类于肌尾噬菌体科（Myoviridae），Tevenvirinae亚科，Mosigvirus属，未分类的Mosigvirus物种（unclassified Mosigvirus），这就将为大肠杆菌病的噬菌体应用及防控奠定基础。关键词：多重耐药；大肠杆菌；噬菌体；分离；鉴定；基因组分析中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）01-0101-15DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5773引用格式：魏炳栋，丛聪，于维，等.1株多重耐药大肠杆菌噬菌体的分离、
4、鉴定、生物学特性及全基因组分析J.吉林农业大学学报，2023，45（1）：101-115.Isolation,Identification,Biological Characteristics and Whole Genomic Analysis of a Multi-drug Resistant E.coli phage*WEI Bingdong1，2，3，CONG Cong4，YU Wei1，3，XU Yongping2，4*，LI Jibin2，LI Shuying21.Branch of Animal Husbandry，Jilin Academy of Agricultural Sc
5、iences，Gongzhuling 136100，China；2.Dalian SEM Bio-Engineering Technology Co.，Ltd.，Dalian 116620，China；3.Jilin Jijia Feed Additives Co.，Ltd.，Gongzhuling 136100，China；4.School of Bioengineering，Dalian University of Technology，Dalian 116024，ChinaAbstract：Using a multi-drug resistant Escherichia coli F2
6、as host strain,a Myoviridae lytic phage,vB_EcoM_F2,was isolated from farm sewage.Phage vB_EcoM_F2 could infect most test strains of E.coli.The general characteristic analysis results showed that the optimal multiplicity of infection was 1.With a burst size of 101 PFU/infected cell,the incubation per
7、iod was 30 minutes and the outbreak period was 90 minutes.It was not sensitive to chloroform and could maintain high activity un*基金项目：吉林省农业科技创新工程杰出青年项目（CXGC2017JQ002），吉林省科技发展计划项目（20160626002NY）作者简介：魏炳栋，男，博士，副研究员，研究方向：噬菌体在动物细菌性感染中的应用。收稿日期：2020-04-23*通信作者：徐永平，E-mail：吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin
8、 Agricultural University 2023，Februaryder the condition of 40-50,pH value 4.0-10.0.The genome length of the phage was 168 241 bp according to the whole genome sequencing result.With 37.32%of a(G+C)%content,the genomic included 263 ORFs,113 of which were known coding sequences.It contained 2 tRNA,but
9、 no lysogenic genes,virulence factors,or antibiotic resistance genes.The whole-genome and phylogenetic tree of the terminase large subunit protein analysis showed that phage vB_EcoM_F2 was closely related to Shigella phage phi25-307,but could not infect the standard Shigella sp.strains.At present,th
10、e International Committee on Taxonomy of Viruses(ICTV)and the National Center for Biotechnology Information(NCBI)have already classified phage F2 into Myoviridae family,Tevenvirinae subfamily,Mosigvirus genus,unclassified Mosigvirus.This study will lay foundation for the application of phage in cont
11、rol of E.coli disease.Key words：multi-drug resistance；E.coli；phage；isolation；identification；genomic analysis致病性大肠杆菌，即大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）对人和动物具有较强的病原性，往往能够引起严重的腹泻和败血症。在临床上，基本是采用抗生素治疗大肠杆菌病。近些年，随着抗生素类药物的大量使用，尤其在我国，抗生素作为饲料添加剂长期添加于饲料中，使得包括大肠杆菌在内的各种致病菌产生耐药性，而且耐药谱不断扩大，传播速度也越来越快，严重威胁着人们的健康和公共卫生安全
12、1-3。在细菌耐药性日益突出的当下，全球养殖业已经全面掀起“禁抗”的热潮，2019年7月10日，我国农业农村部发布公告，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，加快了我国进入“无抗时代”的脚步。噬菌体（Bacteriophage）是一类能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋菌等微生物的病毒总称。噬菌体在自然界分布极为广泛，被誉为是“生物圈最丰富的生物实体”4，据估算，每毫升养殖水体中有104108个噬菌体，每克土壤中噬菌体含量超过109个，地球上噬菌体的总数可达1032个5。早在1896年，英国微生物学家Ernest Hanbury Hankin在印度恒河中发现一种能够
13、抑制霍乱弧菌的未知微生物；随后，英国微生物学家 Frederick Twort（1915年）和加拿大微生物学家Flix dHerelle（1917年）相继发现噬菌体的存在，并由后者首次提出“Bacteriophage”的概念6。噬菌体以其特殊的宿主专一性，自发现之初就成为人类对抗细菌的利器，广泛用于治疗皮肤、眼科、泌尿、儿科、口腔、耳鼻喉及外科等急慢性细菌感染7-9。但是，由于20世纪40年代开始抗生素的量产，以及噬菌体本身存在的缺陷，除前苏联、东欧等国家外，欧美国家的噬菌体研究一度陷入中断。20世纪90年代，多重耐药菌的状况日益严重，人类期望寻求抗生素的替代品，西方发达国家又重新开始重视噬菌
14、体的研究。同时，由于分子生物学的快速发展，使得人们对噬菌体基因组分析、起源与进化、噬菌体-宿主相互关系以及细菌的致病性等方面有了深入的理解。噬菌体以其宿主专一性高、自我复制能力强、研发周期短、成本低等优势，成为理想的抗生素替代品之一。目前，噬菌体已经广泛应用于人类、动植物细菌性感染的治疗，以及环境、食品和饲料中病原菌的清除等方面。本研究以多重耐药大肠杆菌为宿主菌，从养殖场污水中分离出1株裂解性噬菌体，并对其进行生物学特性及全基因组分析，明确其分类地位，从基因水平上证明其安全性，以期为防控大肠杆菌感染提供新的防治手段。1材料与方法1.1样品来源宿主菌E.coli F2以及E.coli E6，E8
15、，E11，E13和F1分离自吉林省农业科学院畜牧分院养猪场排泄物，由吉林省农业科学院畜牧分院抗生素替代品实验室自主保存。鉴定宿主谱所用产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）K88 以及E.coli 236，233，238，F5和F18等菌种均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），E.coli 12588购自北纳生物（BNCC），产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E.coli，STEC）10668，以及 志 贺 菌（Shigella spp.）和 沙 门 菌（Salmonella spp.）等菌种均购自中国普通微生物保藏
16、管理中102魏炳栋，等：1株多重耐药大肠杆菌噬菌体的分离、鉴定、生物学特性及全基因组分析吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University心（CGMCC）。同时，采集养猪场污水用于分离噬菌体。1.2培养基的配制1.2.1LB液体培养基胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，溶于 1 L 纯净水中，pH 7.0，121 灭菌20 min，常温保存备用。1.2.2LB固体培养基（下层培养基）在LB液体培养基配制基础上添加琼脂粉18 g，其他条件不变。1.2.3LB半固体培养基（上层培养基）在LB液体培养基配制基础上添加琼脂粉9 g，其他条件不变。1.3SM缓冲液的配制NaCl 5.8 g，MgSO4 7H2O 2 g，1 mol/L Tris-HCl 50 mL，2%明胶 5 mL，溶于 1 L 纯净水中，121 灭菌20 min，常温保存备用。1.4菌液制备及药敏测定利用药敏纸片法检测临床上常用20种抗生素的耐药以及敏感情况，具体操作根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standa
