1、基金项目:国家自然科学基金资助项目(面上项目)(81372827)作者单位:100071北京,中国人民解放军总医院第五医学中心肺部肿瘤内科(赵静、唐秀花、王红);510515广州,南方医科大学第二临床医学院(黄珺霞)通信作者:王红,硕士生导师,电子信箱:wanghong56 HOXA11-AS/miR-149-3p 通路在肺鳞状细胞癌中的作用及机制研究赵静黄珺霞唐秀花王红摘要目的探究长链非编码 RNA HOXA11-AS 在肺鳞状细胞癌发生过程中的确切机制。方法采用定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测 HOXA11-AS、miR-149-3p 和 SPT16 表达变化。并通过 MTT 法检
2、测细胞活力。双荧光素酶报告基因检测 miR-149-3p 与 HOXA11-AS 或 SPT16 的互作关系。结果在肺鳞状细胞癌组织和细胞中 HOXA11-AS 和 SPT16 的表达升高,而 miR-149-3p 的表达降低。miR-149-3p 是 HOXA11-AS 的作用靶点,而 SPT16 是 miR-149-3p 的作用靶点。HOXA11-AS 的敲低抑制了肺鳞状细胞癌细胞的增殖能力,而使用 miR-149-3p 抑制剂可拮抗 HOXA11-AS 敲低对肺鳞状细胞癌细胞增殖的 抑 制 作 用。此 外,上 调 SPT16 可 减 弱 si-HOXA11-AS 介 导 的 肺 鳞 状
3、细 胞 癌 细 胞 的 抗 增 殖 作 用。结 论HOXA11-AS的敲低可通过调控 miR-149-3p/SPT16 轴在肺鳞状细胞癌中发挥抑癌作用。关键词肺鳞状细胞癌HOXA11-ASmiR-149-3p竞争性内源 RNA中图分类号R734文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.007Role and Mechanism of HOXA11-AS/miR-149-3p Pathway in Lung Squamous cell Carcinoma.ZHAO Jing,HUANG Junxia,TANGXiuhua,et al.Departme
4、nt of Pulmonary Neoplasm Internal Medicine,Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing100071,ChinaAbstractObjectiveTo explore the exact mechanism of long non-coding RNA HOXA11-AS in lung squamous cell carcinoma.MethodsThe expression of HOXA11-AS,miR-149-3p and SPT16 was detected by
5、quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).The cell viability was detected by MTT method.Double luciferase reporter gene was used to detect the interaction between miR-149-3p and HOXA11-AS or SPT16.ResultsThe expression of HOXA11-AS and SPT16 was increased,while the expression ofmiR-149-3p was
6、decreased in lung squamous cell carcinoma.MiR-149-3p was the target of HOXA11-AS,while SPT16 was thetarget of miR-149-3p.HOXA11-AS knockdown inhibited the proliferation of lung squamous-cell carcinoma cells,while the inhibi-tion of HOXA11-AS knockdown on the proliferation of lung squamous cell carci
7、noma cells could be antagonized by the use of miR-149-3p inhibitor.In addition,up-regulation of SPT16 can weaken the anti-proliferation effect of si-HOXA11-AS-mediated lungsquamous cell carcinoma cells.ConclusionThe knockdown of HOXA11-AS may play an inhibitory role in lung squamous cell carcino-ma
8、by regulating the miR-149-3p/SPT16 axis.Key wordsLung squamous cell carcinoma;HOXA11-AS;MiR-149-3p;Competitive endogenous RNA肺鳞状细胞癌是一种常见的癌症1。近年来,随着临床技术的不断发展,肺鳞状细胞癌的诊疗方法相比以前有了一定的进步2,3。然而,手术、化疗和放疗等常规治疗方法由于转移、复发和耐药等原因,并没有明显提高晚期患者的生存率4,5。因此,深入研究和阐明肺鳞状细胞癌的发生机制,对于该类疾病的诊治具有重要意义。长链 非 编 码 RNA(long non-coding
9、 RNA,lncRNA)在癌症的发生、发展过程中发挥了重要的作用6 9。研究发现,lncRNA 在肺鳞状细胞癌中处于异常表达的状态,提示其可能与肺鳞状细胞癌的发生、发展和预后相关。例如,LINC00511 在肺鳞状细胞癌中作为癌基因而发挥作用,有可能成为肺鳞状细胞癌患者诊断的生物学标志物和治疗靶点10。此外,lncRNA HOXA11-AS 被确定为多种人类癌症病理过程中的致癌基因,如胰腺癌和结直肠癌11,12。提示其可能在癌症相关疾病中发挥着重要作用。然而,尚不清楚 HOXA11-AS 在肺鳞状细胞癌中是否03论著J Med Res,February 2023,Vol.52 No.2也具有重
10、要的调控作用。非编码小分子 RNA(mi-coRNA,miRNA)是一类内源性非编码短 RNA,其长度为 19 25 个核酸,可与 3-非翻译区结合,转录后可通过与 mRNA 结合,导致基因沉默13,14。此外,据报道,miR-149-3p 可以抑制某些人类癌症的发生和发展,如骨肉瘤15。但是,miR-149-3p 是否可作为 HOXA11-AS 的下游分子而介导肺鳞状细胞癌的发展鲜见报道。SPT16 是染色质转录促进复合体的重要组成部分,是一种组蛋白伴侣,其在基因转录、DNA 复制和 DNA 修复过程中发挥重要作用。有趣的是,SPT16 可以作为肺癌的预后指标16。然而,SPT16 在肺鳞状
11、细胞癌中的作用尚不清楚。因此,笔者研究了 HOXA11-AS 的表达水平及其对肺鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡和转移以及肿瘤生长的影响,以及其与 miR-149-3p 和 SPT16 在肺鳞状细胞癌可能的调控机制。材料与方法1.组织来源:收集 2018 年 6 月 2019 年 6 月收治于笔者医院的肺鳞状细胞癌患者手术切除癌组织和癌旁组织 30 例。在切除手术中获得癌组织及对应的相邻正常组织,并立即保存在液氮容器中。所有受试者均符合肺鳞状细胞癌的诊断标准,术前均未接受放疗、化疗或其他治疗。所有患者均签署知情同意书,本研究已通过笔者医院医学伦理学委员会审批。2.细胞 培 养 和 转 染:人 肺 鳞
12、状 细 胞 癌 细 胞 系NCI-H226、NCI-H520、SK-MES-1 和正常肺上皮细胞系 BEAS-2B 购自中国科学院细胞所(上海)。所有细胞均用含 8%胎牛血清(以色列 BI 公司)的DMEM 培养基(美国 Gibco 公司)培养在 37 含 5%CO2的恒温培养箱(美国 Thermo 公司)中。靶向 HOXA11-AS 的小干扰 RNA(siRNA)(si-HOXA11-AS)及其阴性对照(si-NC)、miR-149-3p 抑 制 剂(anti-miR-149-3p)及 其 阴 性 对 照miR-NC 抑制剂(anti-miR-NC)、miR-149-3pmimics(miR
13、-149-3p)及其 阴性对照 miR-NCmimic(miR-NC)由中国上海基因制药有限公司设计合成。对于 HOXA11-AS 和 SPT16 的过表达,由汉恒生物技术有限公司(中国上海)构建相应的过表达质粒 pcDNA-HOXA11-AS(HOXA11-AS),同时,以非靶向质粒(pcDNA)为阴性对照。根据用户手册,使用 Lipofectamine 3000 将上述寡核苷酸或质粒转染到肺鳞状细胞癌细胞 NCI-H520 中。3.定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR):使用RNA 分离试剂盒(美国 Sigma-Aldrich 公司)从肺鳞状细胞癌组织和配对的相邻正常组织、肺鳞状细胞癌细
14、胞中分离总 RNA。对于互补 DNA(cDNA)的合成,使用 1g RNA,借助高容量 cDNA 反转录试剂盒。选用 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 检测HOXA11-AS 和 SPT16mRNA 的表达。miR-149-3p 分析使用 all-in-one MIRNA RT-qPCR 试剂盒。HOXA11-AS、miR-149-3p 和 SPT16 的相对表达采用 2-Ct方法进行评估。RT-qPCR 研究中涉及的引物序列详见表 1。表 1RT-qPCR 引物序列基因名称引物序列(53)HOXA11-AS上游引物:GCCCCTTCTATGGGAATCA
15、CA下游引物:GGGGCAGAGATGAAATCGTAATSPT16上游引物:GAAGCAGAAAGAGCGGGA下游引物:CTGTGAAAATGCGGCTGGAGAPDH上游引物:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT下游引物:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGGmiR-149-3p上游引物:ACTGGCCTAAGTACACCCAGT下游引物:GCTGCGAAG TGGAACCATCU6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA下游引物:AACGCTTCACGAATTTTGCGT4.MTT 细胞增殖测定:用四甲基偶氮唑盐细胞活力分析试剂盒(美国 Sigma 公司)检测细胞活力
16、。将转染后的细胞接种于 96 孔板(200l,3 103个/孔)。每孔加入 10l 四甲基偶氮唑盐(5mg/ml)继续孵育 4h,沉淀溶解于二甲基亚砜(100l)中。在分光光度计下于 490nm 波长处测定吸光度(A)值。5.Transwell 实验:细胞被胰酶消化,并放置在上室中,其中包含非涂层膜。下室加入 600l 1%胎牛血清。37 孵育 24h 后,用棉签去除膜的上表面,而下表面的细胞用 0.1%结晶紫染色 30min。为了进行侵袭试验,按照试剂说明进行 Matrigel 小室实验。收集转染组细胞(200l,5000 个/孔),悬浮于无血清培养液中,移入 50l 的小室。在含 10%胎牛血清的500l DMEM 培养液中培养过夜。将上表面的细胞刮去,将下表面的侵袭细胞固定,用 0.1%结晶紫染色半小时。6.双荧光素酶报告基因试验:利用 miRcode 和target Scan Human7.2 在线软件预测 HOXA11-AS、miR-149-3p、SPT16 的相互作用关系。构建了含有miR-149-3P 野生型(WT)和突变型(MUT)结合位点的荧光素酶表达载体。进一步,将
