1、 2 0 2 3年河北大学学报(自然科学版)2 0 2 3第4 3卷 第2期J o u r n a l o f H e b e i U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 3 N o.2D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0 1 5 6 5.2 0 2 3.0 2.0 1 0m i R-1 9 4-5 p通过W n t5a抑制肝星状细胞活化李亚琦1,张荣花1,刘雨潭1,曹雨萌1,熊亚南1,章广玲2(1.华北理工大学 基础医学院,河北省慢性疾病重点实验室,河北 唐山
2、 0 6 3 2 0 0;2.华北理工大学 临床医学院,河北省医工融合精准医疗重点实验室,河北 唐山 0 6 3 2 0 0)摘 要:为研究m i R-1 9 4-5 p对肝星状细胞(H S C s)活化的影响及作用机制,采用C C K-8、-半乳糖苷酶染色、T r a n s w e l l、划痕、集落形成实验和R T-q P C R、W e s t e r n b l o t分别检测m i R-1 9 4-5 p 对L X-2细胞生物学特性、细胞活化标志物和靶基因表达的影响,并用生物信息学和双荧光素酶报告实验确定m i R-1 9 4-5 p靶基因.结果显示:m i R-1 9 4-5 p
3、抑制L X-2细胞增殖、细胞集落形成、迁移能力以及L X-2细胞中活化标志物的表达,促进L X-2细胞衰老;W n t5a为m i R-1 9 4-5 p的直接靶基因.研究表明m i R-1 9 4-5 p通过靶定W n t5a抑制L X-2细胞活化,m i R-1 9 4-5 p和W n t5a可能是治疗肝纤维化新的靶点.关键词:m i R-1 9 4-5 p;肝纤维化;肝星状细胞活化;增殖;迁移中图分类号:R 5 7 5.2 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 0 1 5 6 5(2 0 2 3)0 2 0 1 7 9 0 9m i R-1 9 4-5 p i n h i b i t s
4、 a c t i v a t i o n o f h u m a n h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s t h r o u g h W n t5aL I Y a q i1,Z H A N G R o n g h u a1,L I U Y u t a n1,C A O Y u m e n g1,X I O N G Y a n a n1,Z H A N G G u a n g l i n g2(1.H e b e i K e y L a b o r a t o r y f o r C h r o n i c D i s e a s e s,S c h
5、o o l o f B a s i c M e d i c i n e,N o r t h C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,T a n g s h a n 0 6 3 2 0 0,C h i n a;2.H e b e i P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f M e d i c a l-I n d u s t r i a l I n t e g r a t i o n P r e c i s i o n M e d
6、i c i n e,S c h o o l o f C l i n i c a l M e d i c i n e,N o r t h C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,T a n g s h a n 0 6 3 2 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s a n d m e c h a n i s m o f m i R-1 9 4-5 p o n t h e a c
7、t i v a t i o n o f h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s(H S C s),C C K-8,-g a l a c t o s i d a s e s t a i n i n g,T r a n s w e l l,w o u n d h e a l i n g,c o l o n y f o r m a t i o n a s s a y s,R T-q P C R a n d W e s t e r n b l o t w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e f f e c t s o f
8、m i R-1 9 4-5 p o n t h e c e l l b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s,t h e e x p r e s s i o n o f H S C a c t i v a t i o n m a r k e r s a n d t a r g e t g e n e,r e s p e c t i v e l y.T h e c a n d i d a t e t a r g e t g e n e s o f m i R-1 9 4-5 p w e r e c o n f i r m e d b y t h e b i
9、o i n f o r m a t i c s w e b s i t e a n d d u a l l u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p r o l i f e r a t i o n,c e l l c o l o n y f o r m a t i o n,m i g r a t i o n a b i l i t y a n d H S C a c t i v a t i o n m a r k e r s e x p r e s s
10、i o n o f L X-2 c e l l s w e r e i n h i b i t e d b y m i R-1 9 4-5 p;t h e s e n e s c e n c e w a s p r o m o t e d b y m i R-1 9 4-5 p;a n d 收稿日期:2 0 2 2 0 6 0 7 基金项目:河北省自然科学基金资助项目(H 2 0 2 1 2 0 9 0 2 6);河北省人力资源和社会保障厅项目(C 2 0 2 1 0 3 4 0);2 0 2 0年政府资助临床医学优秀人才培养项目(冀财预付2 0 2 03 9 7号)第一作者:李亚琦(1 9
11、9 7),女,河北邯郸人,华北理工大学在读硕士研究生,主要从事肝纤维化分子机制方向研究.E-m a i l:8 7 1 5 2 8 0 0 7q q.c o m 通信作者:熊亚南(1 9 7 8),女,河北唐山人,华北理工大学副教授,主要从事肝纤维化分子机制方向研究.E-m a i l:x i o n g y a n a n n c s t.e d u.c n章广玲(1 9 7 2),女,河北唐山人,华北理工大学教授,博士,主要从事肝纤维化分子机制方向研究.E-m a i l:z h a n g g l n c s t.e d u.c nW n t5a w a s a t a r g e t
12、g e n e o f m i R-1 9 4-5 p.O u r f i n d i n g s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t m i R-1 9 4-5 p i n h i b i t s L X-2 c e l l a c t i v a t i o n b y t a r g e t i n g W n t5a.T h e r e f o r e,m i R-1 9 4-5 p a n d W n t5a m a y b e p o s s i b l e n o v e l t h e r a p e u t i c t a r g e
13、t s f o r h e p a t i c f i b r o s i s.K e y w o r d s:m i R-1 9 4-5 p;h e p a t i c f i b r o s i s;h e p a t i c s t e l l a t e c e l l a c t i v a t i o n;p r o l i f e r a t i o n;m i g r a t i o n肝纤维化是由饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和胆汁淤积性肝病等因素引起的慢性肝损伤反应1.肝星状细胞(h e p a t i c s t e l l a
14、t e c e l l s,H S C s)是正常及纤维化肝脏中细胞外基质(e x t r a c e l l u l a r m a t r i x,E CM)的主要合成细胞,活化的H S C s会分泌多种物质且抑制E CM的降解,导致E CM的沉积,形成肝纤维化2-3.在体外培养中,肝星状细胞(例如L X-2)逐渐发生活化4,而活化的H S C s产生的E CM在肝纤维化晚期的肝脏中可能会达到正常情况的6倍5-6,T G F-1可进一步刺激L X-2活化7.因此抑制L X-2的活化和E CM的沉积越来越受到关注,成为治疗肝纤维化的方向之一.m i R NA通过靶向参与细胞发育、分化、增殖和
15、凋亡以及新陈代谢、癌症发生和病毒感染过程中的各种mR NA的3 非翻译区(3UT R)调节靶基因表达8-9,如m i R-1 9 4-5 p通过靶向ME F2C抑制兔骨骼肌卫星细胞的增殖和分化1 0,并且在人瘢痕疙瘩成纤维细胞(K E L-F I B s)中通过靶向NR2F2抑制K E L-F I B s细胞的增殖和迁移1 1.m i R NA在肝脏中大量表达,一些源于肝脏的m i R NA可以分泌到血液中,并在血清中被检测到1 2,但是m i R-1 9 4-5 p与肝纤维化关系的研究鲜见报道.课题组前期利用胆总管结扎的方法诱导胆汁淤积性(B D L)大鼠肝纤维化模型,m i R NA s表
16、达谱芯片分析显示m i R-1 9 4-5 p在B D L大鼠肝组织中表达下调,因此本研究选择m i R-1 9 4-5 p作为研究对象1 3.本研究通过脂质体将m i R-1 9 4-5 p的m i m i c s和i n h i b i t o r转染到肝星状细胞L X-2中,检测过表达或沉默m i R-1 9 4-5 p对L X-2细胞增殖、迁移、集落形成能力的影响,为肝纤维化的临床诊断和治疗提供实验依据.1 材料和方法1.1 主要材料人肝星状细胞系L X-2购自武汉普诺赛生物技术有限公司;DMEM培养基、DMEM/F 1 2培养基、青霉素-链霉素双抗(P S)和胰酶均购自美国G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自美国B I公司;T G F-1购自美国P e p r o t e c h公司;l i p 2 0 0 0、T r i z o l总R NA提取试剂购自美国 I n v i t r o g e n公司;W n t5a-MUT、W n t5a-WT质粒购自安徽通用生物有限公司;C C K-8试剂盒购自北京庄盟生物基因有限公司;细胞衰老-半乳糖苷酶试剂盒购自上海碧
