1、病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月20102021年杭州市儿童埃可病毒感染及流行特征分析邱晓枫，李钧，张国忠，于新芬，潘劲草，赵刚*（杭州市疾病预防控制中心，杭州 310021）摘要：研究杭州市儿童感染埃可病毒（Echovirus，E）状况和流行病学特征。收集 20102021年杭州市发热患儿咽拭子、肛拭子等临床样本。首先通过实时荧光 RTPCR 试剂盒进行肠 道 病 毒（Enterovirus，EV）通 用筛查。选取 Ct值30且 EVA71、CVA16、CVA6、C
2、VA10均为阴性的 EV 阳性核酸样本，用普通 PCR方法扩增 EV VP1序列。获得 VP1序列通过 GenBank进行 BLAST 比对，确定埃可病毒血清型，并对埃可病毒优势血清型构建遗传进化树。通过回顾性调查埃可病毒阳性患儿的临床资料进行流行病学特征分析。采用卡方检验对埃可病毒阳性患儿的采样时间、年龄、性别等进行分组比较。本研究共收集临床样本 7 835份，获得 EV 通用阳性样本数共计 2 023份。选取 827份 Ct值30且 EVA71、CVA16、CVA6、CVA10均为阴性的 EV 通用核酸阳性样本；共检出埃可病毒 68份，8个血清型，阳性率为 8.22%；分别为 21 份 E
3、30、12 份 E9、13 份 E6、7 份 E11、11 份 E18、2 份 E25、1 份 E7、1 份 E3。春、夏、秋、冬四季的埃可病毒阳性率分别为 4.37%、21.03%、1.75%、1.22%。04岁、47岁、714岁患儿的埃可病毒阳性数分别为 29、23、16，在 EV 阳性病例中的阳性率分别为 5.24%、10.09%、34.78%。男、女童埃可病毒阳性率分别为 9.48%、6.13%。埃可病毒阳性患儿临床诊断主要以急性上呼吸道感染为主，有 29例占 42.65%；其次是病毒性脑炎 25例占 36.76%；再是手足口病 11例占 16.18%。构建 E30遗传进化树，发现杭州
4、 21株 E30病毒株有多个不同进化分支，可能存在不同的流行传播链。E30 杭州株之间核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 88.0%100.0%、97.3%100.0%。20102021年期间，夏季是杭州市儿童埃可病毒感染的高发季；建议医疗机构在夏季加强埃可病毒监测，有效预防和控制夏季埃可病毒引起的疫情暴发流行。关键词：埃可病毒；发热儿童；病毒性脑炎；手足口病；VP1基因；流行病学中图分类号：R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02040109DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004240埃可病毒（Echovirus，E）属于小 RNA 病毒
5、科（Picornaviridae）中 肠 道 病 毒（Enterovirus，EV）B组，有 19，1127，2933 等 31 个血清型，是引起儿童病毒性脑炎最常分离到的病毒之一1。据报道马来西亚 20022013年期间进行埃可病毒流行血清型研究2。该研究在 31 例来自非脊髓灰质炎急性弛 缓 性 麻 痹、手 足 口 病（Hand foot and mouth disease，HFMD）、病毒性脑膜炎和 EV 病例回顾性样本中发现感染病原主要为 E11，依次是 E6、E7、E3、E9、E30、E1。2010 2016 年 广 东 省 在 196 例HFMD 重症病例中检出 E1、E3、E6、
6、E9、E11、E14、E16、E25 和 E303。为了解杭州市儿童埃可病毒流行 的 血 清 型，本 研 究 通 过 流 感 监 测 哨 点 医 院 和HFMD 监测网络实验室保存的临床样本进行 EV 筛查，对 Ct 值 30 且 EV A71、CVA16、CVA6、CVA10 均为阴性的 EV 阳性核酸样本进行 PCR 扩增 EV 部分 VP1序列分型。回顾性调查分析埃可病毒阳性病例的流行病学资料，探讨埃可病毒防控策略。材料与方法1 标本来源和主要检测试剂、仪器20102021 年期间杭州市发热患儿标本主要来自国家流感监测哨点医院和各区县 HFMD 监测网络实验室收集上送的咽拭子、肛拭子、粪
7、便等样本7 835 份。其中流感样病例标本 4 990 份，采样对象为发热（腋下体温38），伴咳嗽或咽痛。HFMD病例标本 2 845 份，采样对象为急性起病发热、手足臀部出现斑丘疹、疱疹、口腔粘膜或咽峡部出现散在疱疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、腹泻等症状。上述样本使用病毒 RNA/DNA 提取试剂盒（购自西安收稿日期：20220824；接受日期：20221101基金项目：杭州市农业与社会发展科研计划项目（项目号：20170533B76），题目：杭州市区手足口病患儿中埃可病毒的检测及其分子特征研究作者简介：邱晓枫（1979），女，副主任技师，从事病毒性传染性疾病防控研究，Email：通讯作者
8、：赵刚（1966），男，主任医师，从事传染病防制工作，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷天隆科技有限公司），按说明书提取病毒核酸 RNA。主要检测试剂盒为 EV 通用实时荧光 RTPCR 试剂盒、EVA71/CVA16 和 CVA6/CVA10、甲/乙型流感病毒双通道实时荧光 RTPCR 试剂盒（均购自江苏硕世生物科技有限公司）。主要的检测仪器有Esco级生物安全柜、自动核酸提取仪天隆 NP968S、ABIQuantStudio5荧光定量 PCR仪等。2 EV筛查及埃可病毒检测选 取 EV 通 用 阳 性，但 EV A71、CVA16、CVA6、CVA10 均为阴性，且 Ct
9、 值30 的 RNA 样本。使用反转录试剂盒 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，用随机引物合成 cDNA。参考文献4，5合成 EV VP1 血清分型特异性引物，011/012、011/040 扩 增 PCR 产 物 均 为 450bp。P4/P7、P5/P7、P6/P7 扩 增 PCR 产 物 均 为 350bp。选 用TaKaRa Ex Taq Hot Start Version 试剂盒，按照说明书配置反应条件扩增 EV 部分 VP1基因。上述试剂盒均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。扩增产物序列测定委托生工生物工程（上海）股份有限公
10、司完成。测序结果通过 NCBI 网站在线 BLAST比对确定埃可病毒血清型。3 遗传进化分析埃 可 病 毒 优 势 血 清 型 VP1 核 苷 酸 序 列 使 用DNAStar 及 MEGA4.1 软 件 进 行 同 源 性 比 较，Bootstrap Test邻接法构建基因进化树，各参比序列均来自 NCBI 网站的 GenBank。用 MegaAlign 软件Clustal W 法进行 VP1 序列核苷酸和氨基酸同源性分析。4 阳性病例流行病学特征分析根据埃可病毒阳性患儿的采样时间、年龄、性别等进行分组分析。采用 SPSS16.0统计软件，定性资料采用相对数描述，组间比较采用卡方（2）检验，
11、检验水准=0.05。根据埃可病毒阳性病例的采样时间按季节进行分类分析；春 35月、夏 68月、秋 911 月、冬 12 月次年 2 月。年龄按照 04 岁、47岁、714岁分组。性别按男女分组。结 果1 埃可病毒核酸分型检测结果20102021年期间杭州市流感样病例和 HFMD病例共收集 7 835 份样本，经 EV 通用荧光 RTPCR筛查出阳性数共计 2 023份。其中 4 990份流感样病例样本中检出 EV 阳 性 331 份，阳 性 率 为 6.63%；2 845 份 HFMD 病例样本中检出 EV 阳性 1 692 份，阳 性 率 为 59.47%。选 取 Ct 值 30 且 EV
12、A71、CVA16、CVA6、CVA10均为阴性的 EV通用核酸阳性样本，其中流感样病例中选取了 286份，HFMD病例中选取了 541份，共计 827份。286份流感样病例样本中检出埃可病毒 22 份，阳性率 7.69%；541 份HFMD 病 例 样 本 中 检 出 埃 可 病 毒 46 份，阳 性 率8.50%。共计检出埃可病毒 68份，检出率为 8.22%；有 8个血清型，分别为 21份 E30、12份 E9、13份 E6、7 份 E11、11 份 E18、2 份 E25、1 份 E7、1 份 E3（表1，图 1）。2 采样季节、年龄、性别等流行病学特征分析结果2.1 采样季节分析结果
13、68份埃可病毒阳性患儿发病采样时间分布 1月2 例、3 月 1 例、4 月 2 例、5 月 6 例；68 月分别为 24、17、10 例；9 月份 5 例；10 月份 1 例（图 2）。春、夏、秋、冬四季 EV 阳性患儿病例数分别为 183、252、228、164；其中埃可病毒阳性数分别为 9、53、4、2，阳性率为 4.37%、21.03%、1.75%、1.22%。通过卡方检验显示四季总体差异有统计学意义（2=82.779，P=0.000）；而春、秋、冬三季之间阳性率差异无统计学意义（2=5.742，P=0.057）。通过卡方检验两两比较发现夏季埃可病毒阳性率均高于春季（2=22.523，P
14、=0.000）、秋季（2=42.507，P=0.000）、冬季（2=33.989，P=0.000），由此可见夏季是埃可病毒的高发季（表 2）。2.2 年龄分析结果04 岁、47 岁、714 岁 EV 阳性患儿病例数分别为 553、228、46，其中埃可病毒阳性数分别为表 120102021年杭州市 EV阳性发热患儿埃可病毒检测结果Table 1The results of echovirus detected in children with fever and EV positive from 2010 to 2021 in Hangzhou City，ChinaSource of samp
15、lesInfluenzalike illnessHFMDlike illnessTotalTotal of EV positive286541827E3101E65813E7011E911112E11527E189211E25022E3012021Total of Echovirus224668Positive rate（%）7.698.508.22 4022期邱晓枫，等.20102021年杭州市儿童埃可病毒感染及流行特征分析29、23、16，阳性率分别为 5.24%、10.09%、34.78%。通过卡方检验显示 04岁、47岁、714岁三组之间埃可病毒阳性率总体差异有统计学意义（2=50.5
16、53，P=0.000）。通过两两比较发现 04岁和 47岁两组之间埃可病毒阳性率差异有统计学意义（2=6.094，P=0.014）；04 岁和 714 岁两组之间阳性率差异有统计学意义（2=53.329，P=0.000）；47岁和 714岁两组之间埃可病毒阳性率差异有统计学意义（2=19.122，P=0.000）（表 2）。2.3 性别分析结果EV 阳性患儿共计男 517 例、女 310 例，检出埃可病毒阳性数分别为 49、19，阳性率分别为 9.48%、6.13%，通过卡方检验阳性率差异无统计学意义（2=2.880，P=0.116）（表 2）。图 120102021年杭州市 EV阳性发热患儿埃可病毒检测结果Figure 1The results of echovirus detected in children with fever and EV positive from 2010 to 2021 in Hangzhou City，China图 22010-2021年杭州市 EV阳性患儿发病采样的月份分布情况Figure 2Monthly distribution of echov
