1、第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 202320172021年宁夏急性驰缓性麻痹病例监测系统非脊灰肠道病毒病原鉴定分析袁芳，曹慜，马学平*，马江涛，马学旻，陈慧（宁夏疾病预防控制中心，银川 750004）摘要：为了解宁夏急性驰缓性麻痹病例中（acute flaccid paralysis，AFP）非脊灰肠道病毒（nonpolio enterovirus，NPEV）的流行，本研究对宁夏 20172021年急性驰缓性麻痹病例监测中分离到的 NPEV 进行型别鉴定和基因进化分析。按照监
2、测方案要求采用 RD 细胞和 L20B 细胞分离病毒，分离到的病毒进行 VP1区的全部核苷酸序列测定、基因型别鉴定分析、系统发生学分析。20172021年共收到 969份粪便标本，其中 AFP病例标本 290份，密接者标本679 份。从 969 份标本中共分离到 55 株 NPEV，AFP 病例中分离率 6.16%（9/146，以例计），密接者人群分离率6.7%（46/679）。其中 53株鉴定成功，分别属于人肠道病毒 HEVA、HEVB、HEVC 组，包含 16个血清型别，其中HEVA 组 24 株（45.2%），5 个血清型，以 EV-A71、CVA10、coxsackieviruses（
3、CV）CVA4、为主；HEVB 组 28 株（54.7%），10个血清型，以 echoviruses（ECHO）30、CVB5、CVB3为主，HEVC 组 1株为 CVA24，未分离到 D 组人肠道病毒。宁夏地区非脊灰肠道病毒存在 A 组和 B 组肠道病毒共同循环，肠道 C 组较少见，每年流行的优势血清型不同。关键词：非脊灰肠道病毒；基因型别中图分类号：R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02046008DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004295肠道病毒是小核糖核酸病毒科的一个属，在全球广泛分布，包括肠道病毒（Enteroviruse
4、s，EV）、柯萨 奇 病 毒（Coxsackieviruses，CV）、鼻 病 毒（rhinoviruses，RV）、脊髓灰质炎病毒（Polioviruses，PV）和埃可病毒（Echoviruses，ECHO）。感染人类的肠道病毒为肠道病毒（AD）组，包含有 100 多个血清型。人肠道病毒是导致急性弛缓性肢体麻痹（Acute Flaccid Paralysis，AFP）、手 足 口 病（Hand foot mouth disease，HFMD）、无菌性脑炎或脑膜炎、急性出血性结膜炎、心肌疾病、疱疹性咽峡炎等疾病的主要致病原13。近十年来非脊髓灰质炎肠道病毒广泛流行，与一些神经系统感染病例密切
5、相关4，尤 其 是 EVD68 和 EVA71 在 一 些 城 市 的 暴 发 流行58，导致部分患病儿童持续瘫痪和残疾，这一发展令人担忧。本研究基于宁夏 AFP病例监测系统，对 20172021年实验室收到的 AFP病例样本和密接者人群样本中分离获得的非脊灰肠道病毒进行鉴定分析，明确宁夏近 5年非脊灰肠道病毒的流行趋势，为肠道病毒防控策略的制定提供参考。材料与方法1 标本采集与病毒分离按照 全国急性弛缓性麻痹病例监测方案 的要求，采集 AFP 病例监测系统报告的 AFP 病例（15岁以下儿童）双份粪便标本，同时采集 5 个与 AFP 报告病例密切接触的健康儿童粪便标本为密接者标本。按照 WH
6、O 脊灰病毒实验室操作手册 推荐方法处理标本，4过夜后吸取上清液接种于 RD 细胞和 L20B 细胞上进行病毒分离，单独 RD 细胞出现阳性结果的判定为 NPEV，RD 细胞和 L20B 细胞均出现阳性结果的，进行脊灰型内鉴定实验，鉴定出的脊灰病毒毒株送国家脊灰室测序分析，脊灰型内鉴定为 阴 性 的 判 定 为 NPEV。将 所 有 的 NPEV 放 于 80长期保存。2 RTPCR 与序列测定采用硕世有限公司 RNA提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取病毒 RNA。根据参考文献，按照北京全式金生物技术有限公司的一步法 RTPCR 试剂盒使用说明书，分别使用肠道病毒 A、B、C组引物进行 VP1
7、 区的扩增9，10。反应条件为：42 45 min，95 2 min；94 30 s，52 30 s，72 80 s，40 个循收稿日期：20220726；接受日期：20220922基金项目：宁夏自然科学基金，题目：宁夏地区肠道病毒优势株遗传多样性及分子变迁规律研究，项目编号 2021AAC03415作者简介：袁芳（1984），女，副主任检验技师，从事肠道病毒研究，Email：liaoliao_*通讯作者：马学平（1982），男，主任技师，从事肠道病毒研究，Email：开放科学（OSID）2期袁芳，等.20172021年宁夏急性驰缓性麻痹病例监测系统非脊灰肠道病毒病原鉴定分析环；72 延伸 1
8、0 min。PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳阳性的 PCR 产物送测序公司进行测序。3 病毒遗传进化树分析测序结果使用 SeqMan 软件进行拼接，拼接后的序列与 GenBank数据库进行 BLAST 比较分析或采用肠道病毒分子定型在线分析软件 Enterovirus Genotyping Tool Version 0.1（http：/www.rivm.nl/mpf/enterovirus/typingtool）进行基因定型11。下载原型株标准 VP1 区完整序列与分离株序列进行比对，对 型 别 进 一 步 的 判 定。利 用 DNA star 中 的MegAlign 软件进行
9、同源性分析。分子进化遗传学分析（MEGA）软件包 X 用于系统发育分析。采用邻位连接法（neighborjoining，NJ）构建亲缘关系进化树，可信度评估 Bootstrap设置为 1 000。结果1 病例标本和 NPEV分离情况20172021 年共收集到 146 例 290 份 AFP 病例标本和 679 例健康人群粪便标本。其中男（439 例，占 53%），女（386例，占 46.7%），年龄分布在 1.513岁之间。969 份标本中共分离到 55 株 NPEV，总的分离率为 6.6%，其中 AFP 病例中分离到 9 株，分离率 6.16%（以例计，9/146），密接者样本中分离到 4
10、6株，分离率为 6.7%（46/679）。AFP 病例标本中分离到的 9株，占 16.3%（9/55）；密接者标本中分离到46 株，占 83.6%（46/55）。NPEV 分离率 2020 年最低 4.4%，2017年最高 12.5%（表 1）。2 分子生物学鉴定结果通 过 用 分 子 生 物 学 方 法 对 分 离 到 的 55 株NPEV 进行型别鉴定，除 1株 2018年 AFP 病例样本来源和 1 株 2020 年密接者样本来源未鉴定出型别，其余 53株 NPEV 均鉴定成功，分别属于 A 组人肠道病毒（HEVA）、B 组人肠道病毒（HEVB），C 组人肠道病毒（HEVC），共 16
11、个血清型别，没有 D 组人肠道病毒（HEVD），其中 HEVA 组 24株，包括 5个血清型，分别为 EVA71 8 株、CVA10 7 株、CVA4 7株、CVA2 1株、CVA6 1株；HEVB组 28株，包括 11个血清型，分别为 CVB5 6 株、CVB4 2 株、CVB3 3株、CVB1 2 株、ECHO30 5 株、ECHO29 3 株、ECHO13 3 株、ECHO6 1 株；HEV C 组 1 株 为CVA24。本 次 鉴 定 出 的 血 清 型 别 以 EVA71 和CVA 10为主要型别，分别占 15.0.%和 13.2%，其次是 CVB5、ECHO30分别占 11.3%和
12、 9.4%。从年代分布看，每年分布的血清型不同，2017 年分布的血清 型 主 要 是 EVA71（8 株，3 株 为 AFP 病 例）、ECHO30（5株）、CVA10（5株）、CVB4（2株）、CVA6（1株）。2018年分布的血清型是 CVB5（6株，2株为AFP 病例）、ECHO29（2 株）、CVA4（1 株）、ECHO6（1 株）。2019 年分布的血清型是 ECHO13（3 株）、ECHO11（2 株）、CVA10（2 株）、ECHO29（1 株）。2020年分布的血清型是 CVB1（2株）、CVB3（2株）、CVA2（1 株，为 AFP 病例）。2021 年分布的血清性别是 C
13、VA4（6 株，2 株为 AFP 病例）、CVB2（1 株）、CVA2（1株）、CVA24（1株）（表 2）。3 种系发生分析将 53株分离株的基因序列应用 SeqMan软件整理后，序列结果选用 MegaX 软件构建种系发生树进行分析比较（图 1）。53株 NPEV 毒株明显的分化为3支，属于 HEVA、HEVB 和 HEVC，其中 HEVA组包括 24 株，HEVB 组包括 28 株，HEVC 组 1 株，与 BLAST 分型结果一致。基因进化树显示，不同血清型在基因进化树上相对集中，聚集成一簇，序列较保守，属于同一基因型。不同年份分离株具有代表 性，如 2017 年 主 要 以 EV A7
14、1 和 ECHO30、CVA10 为 主，8 株 EVA71 同 源 性 为（96.4%表 1宁夏 2017-2021年 AFP报告病例及其密切接触者标本 NPEV分离结果Table 1AFP case numbers and NPEV isolation rate in Ningxia Province，China during 20172021Year20172018201920202021TotalAFPCases2932272434146Specimens5864524868290ContactCases139136140112152679TotalCases1681681671361
15、86825NPEV IsolationsAFP330129Contacts18885746Totalisolations211186955Isolation rate%12.56.54.74.44.86.6 461病 毒 学 报39卷99.6%），将本次分离到的 EVA71与宁夏 2017年以前 AFP 中分离到的 EVA71 和宁夏 2017 年手足口病中分离到的 EVA71 构建基因进化树分析，宁夏流行的 EVA71 都属于 C4 基因型，C4a 亚型，2017年度分离的病毒处于不同的小的传播链中（图 2）。2018 年以 CVB5 和 ECHO29 病毒为主，6 株 CVB5同源性为（8
16、4.5%99.0%）。2018年和 2019年宁夏首次分离到了 ECHO29，基因进化分析显示与国内山东和云南近几年的流行株聚为一簇（图 3），与山东的流行株同源性为 86.5%89.5%，云南流行株同源性为 77.6%77.8%。在 2021年宁夏首次分离到了 1 株 HEVC 组流行株为 CVA24，基因进化树上单独处于一个分支。讨论通过对宁夏地区 2017-2021 年急性驰缓性麻痹病例及密接者中的 NPEV 数据分析，宁夏的 NPEV以男性农村儿童多见，主要发生在秋冬季节，这和其它地方的监测结果相一致1214。与 2012-2016 年的监测结果相比15，AFP 报告病例数有了大幅度的减少，2012-2016年总计报告了 214例，2017-2021 年总计报告了 146 例。分离的毒株数量也呈下降趋势、流行的血清型别也减少，2012-2016年宁夏流行的肠道病毒有 23 个血清型别，2017-2021 年只有 16 个血清型别。特别是 2020年宁夏报告 AFP 病例为近 10年最低 24例。2019-2021年这三年病毒分离率也是宁夏近 20 年来最低。分析可能的原因是近年
