1、 南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家现代农业产业技术体系（）；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目（）；国家重点研发计划项目（）；江苏省重点研发计划项目（）；江苏省农业科技自主创新基金（）；长江学者和创新团队发展计划（）；仲英作物种业创新中心和江苏省现代作物生产协同创新中心资助作者简介：许建玉，硕士研究生。通信作者：邢邯，教授，博导，主要从事大豆育种研究，：。许建玉，陆阳，孙睿东，等 在大豆干旱胁迫下的功能分析 南京农业大学学报，（）：，（）：在大豆干旱胁迫下的功能分析许建玉，陆阳，孙睿东，王修帅，丁文涛，邓肃霜，王鹏崴，赵晋铭，郭娜，邢邯（南京农业大学农业农村部国家大豆改良中心 农业农村
2、部大豆生物学与遗传育种重点实验室作物遗传与种质创新利用全国重点实验室 农学院，江苏 南京）摘要：目目的的 本研究旨在解析大豆（）转录因子基因 与干旱胁迫的关系，为 转录因子参与大豆干旱胁迫的分子机制研究奠定基础，也为大豆耐旱转基因育种提供新的基因资源。方方法法 以大豆品种天隆 号为试材，通过荧光定量（）分析 个 基因在干旱胁迫诱导下的表达模式及 在大豆不同组织和植物激素处理下的表达。采用生物信息学方法分析 保守基序和亚细胞定位。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达体系进行 蛋白的亚细胞定位。分别在拟南芥中异源表达 和利用（）技术在大豆中沉默，分析该基因在拟南芥和大豆干旱胁迫中的功能。结结果果 个 基因
3、在干旱胁迫下都被诱导表达，但这 个基因间表达谱存在差异。筛选并克隆得到，其位于大豆 号染色体上，含有 个 结构域，蛋白相对分子质量为，为。基因受到植物激素赤霉素（）和水杨酸（）的诱导表达。蛋白位于细胞核内。异源表达 转基因拟南芥在不同浓度的甘露醇处理下表现出比野生型更短的根，对干旱胁迫更敏感。与空载对照相比，大豆 沉默株系叶片在干旱处理后相对电导率、相对失水率、丙二醛（）含量更低，游离脯氨酸（）含量更高，表现出更强的耐旱性。结结论论 可负向调控植物的耐旱能力。关键词：大豆；干旱胁迫；转基因拟南芥中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（），（），（），（）（）第 期许建玉，等：在大豆干
4、旱胁迫下的功能分析 （），（）（），：；大豆（）是一种广泛种植的重要经济作物，是油料和蛋白质的主要来源。干旱胁迫会对大豆的生长状况、生理功能等方面产生不利影响，导致大豆的品质和产量下降。在极端干旱条件下，大豆产量会减少 以上，甚至绝产。目前对于大豆耐旱性分子调控机制的研究仍不全面，因此需要对大豆耐旱相关基因及其调控机制进行深入解析，为提高大豆耐旱性奠定基础。（）超家族参与植物的生长发育、激素调控、病原反应、逆境胁迫应答等相关生物学过程，是转录因子中最大的一类家族。其中，（）脱水应答元件结合蛋白转录因子是 超家族的亚家族，其仅含 个 个保守氨基酸残基的 保守结构域，以 个 折叠和 个 螺旋模式的
5、典型三维结构形式存在。转录因子广泛参与植物的逆境反应，例如低温、干旱、高温和高盐等非生物胁迫。在大豆中，受干旱诱导，通过提高体内抗氧化酶（、和）活性来增强植株对干旱胁迫的耐受性。等研究了大豆；基因，其表达量受到干旱、高温和低温胁迫诱导。在干旱胁迫下，异源表达 转基因大豆具有较低的蒸腾速率和较高的水分利用率，其单株粒数、单株荚数和总荚数等产量构成要素增加。大豆 可以与 或 结合形成二聚体来调节下游胁迫相关基因的表达，从而提高转基因大豆的耐旱性。此外，转录因子也参与其他植物的耐旱性调控。通过调节小麦褪黑素相关信号通路，提高渗透调节和光合效率进而提高小麦耐旱性。干旱能够诱导拟南芥高表达，其在水分亏缺
6、条件下显著提高拟南芥的耐旱性。过表达 转基因水稻通过增强光合同化作用和减少蒸腾作用，提高水分利用效率，从而增强水稻耐旱性。上述研究表明，转录因子在植物应对干旱胁迫中起着至关重要的作用。当植物遭遇干旱等逆境胁迫时，体内的 含量会迅速提高，以调节抗氧化系统、渗透调节、离子转运和气孔开度来增强植物对干旱胁迫的耐受性。亚家族基因参与 信号通路，包括大豆的 和，马 铃 薯（）的 以 及 胡 杨（）的，在萌发和幼苗早期对胁迫诱导基因的表达和非生物胁迫耐受性都发挥了重要作用。由于植物对 信号和干旱胁迫反应的复杂性，介导的植物耐旱分子机制一直是干旱研究的热点。大豆、通过结合下游靶基因启动子的 顺式作用元件，来
7、调控胁迫相关基因的表达，进而对干旱胁迫做出应答。研究 家族基因对进一步解析大豆耐旱分子机制，指导转基因抗逆育种具有重要意义。然而，转录因子对提高大豆耐旱性的研究仍不全面。因此，本研究利用生物信息学方法对大豆 基因进行全基因组鉴定，并利用拟南芥稳定转化体系和 沉默技术，对其中的（）进行了功能分析，为解析 基因在大豆耐旱中的功能提供重要的理论依据。材料与方法 大豆 家族成员鉴定从（：）网站下载大豆全基因组氨基酸序列，构建本地数据库。从（：）下载已经构建好的典型 保守结构域的隐马尔科夫模型（），用其作为搜索模型，以 为标准，通过 软件在大豆蛋白数据库中搜索能够匹配此模型的蛋白序列。对于同一个基因的不
8、同转录本，选择最长的转录本作为对应基因的蛋白序列。将得到的蛋白序列提交到（：）和（：），分析序列中所含的保守结构域，确保只含有 个 保守结构域，去除序列中属于 亚家族（）和 亚家族（）的成员。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 材料及处理本研究所使用的大豆品种天隆 号由中国油料作物研究所周新安研究员惠赠。在大豆苗期进行干旱处理，处理、和 取大豆根、茎、叶。采用根部浸泡的方法对生长周期为 且长势一致的大豆植株，用 脱落酸（）和 水杨酸（）激素处理，用灭菌 作为对照，处理时间为、和 ，设置 个生物学重复。实时荧光定量 使用 公司的 提取样品总，使用 公司的 （）反转录试剂盒将 反转成，使用 公司
9、的 试剂盒进行，反应在 仪器上进行。内参基因为，表 列出了本试验使用的所有引物。表 试验所用引物 引物名称 上游引物（）下游引物（）用途基因扩增 载体构建 载体构建 载体构建 生物信息学分析使用 在线软件（：）预测蛋白分子质量及等电点。使用 在线软件（：）预测蛋白保守结构域。利用（：）预测 蛋白的亚细胞定位。从 获得 基因组序列和 序列，然后将序列提交到（：）进行外显子和内含子的可视化分析。用（：）预测 蛋白序列的保守基序，最大基序数量为，其他参数为默认。亚细胞定位使用特异性引物（表）从大豆品种天隆 号 的根中克隆。选择酶切位点 和，构建 载体质粒，电转至农杆菌，使用注射器将重悬的农杆菌菌液注
10、射烟草幼苗叶片。用黑暗培养 后的烟草叶片制片，使用蔡司激光共聚焦显微镜（）观察。异源过表达转基因拟南芥选择酶切位点 和，构建 载体质粒并电击转至农杆菌，然后用花浸法侵染野生型拟南芥植株（）。将获得的转基因纯合 代植株与野生型种子播种在无菌 固体培养基中（）盐、蔗糖、琼脂，。首先用次氯酸钠对种子表面进行消毒，并将其置于 固体培养基表面，在 进行 的春化处理后置于光照培养箱（、光 第 期许建玉，等：在大豆干旱胁迫下的功能分析照 黑暗时间为 ）中生长 ，然后将根长为 且长势一致的 和异源表达 拟南芥幼苗转移到含、和 甘露醇的 固体培养基中。继续在、光照 黑暗时间为 的条件下培养 ，测量甘露醇模拟干旱
11、下的拟南芥根长，所有试验均设置 个生物学重复。基于 浇灌侵染法介导的大豆叶片沉默扩增 特异性序列，选择酶切位点 和，构建 载体质粒并电转至农杆菌。根据 浇灌侵染法沉默大豆。侵染结束后，取第 轮三出复叶中的 个叶片用液氮研磨，提取 空载和 沉默大豆叶片，进行 分析，计算沉默效率。大豆基因（）作为内参基因，设置 次生物学重复。相关生理指标的检测选取沉默效率大于 的 沉默株系和对照空载的第 轮三出复叶进行生理指标分析。将叶片置于放有称量纸的无盖培养皿中进行光照处理，在离体叶片失水率测定中，每隔 测量叶片的鲜重，计算方法参照文献。收集干旱前、后 的叶片，参考王文佳等方法测定电导率，使用南京建成生物工程
12、研究所的试剂盒测定脯氨酸和丙二醛的含量。所有生理指标的测定均设置 个生物学重复。数据分析数据分析使用 软件。通过 法分析大豆组织中各基因表达量的荧光定量数据，通过法分析拟南芥中 基因表达量的荧光定量数据；基于 法进行显著性分析。结果与分析 干旱胁迫对大豆 基因的表达的影响通过全基因组鉴定共得到大豆 个 家族基因的转录本（表）。结合本实验室前期转录组数据（：），筛选出受干旱诱导显著，即上调倍数较多的 个 基因，将其命名为（表）。根中 验证表明，这 个 基因均受干旱胁迫诱导（图），分析这 个选定的 转录因子在干旱胁迫下的表达谱，发现 表达量上调最显著。检测结果表明，干旱处理下 在大豆根、茎、叶中均
13、被诱导表达，在干旱 表达受到强烈诱导，达到峰值（图）。无水分亏缺的条件下，在大豆根、茎、叶中的表达量无显著差异；干旱处理后，在根、茎、叶中表达量均显著提高，在根和叶中的表达量高于茎。表 大豆 基因家族的成员鉴定 基因基因序列号 基因基因序列号 基因基因序列号 基因基因序列号 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷续表 基因基因序列号 基因基因序列号 基因基因序列号 基因基因序列号 图 不同时间干旱胁迫下大豆根中 家族基因的表达.，在激素 和 诱导下的表达分析图 不同时间干旱诱导下 在大豆组织中的表达.当植物遭受非生物胁迫时，水平的变化可导致编码抗逆和维持生命周期过程的相关基因表达上调，此外 信号
14、途径还与 信号途径存在相互作用。因此，为了进一步证明 响应干旱是否与 及 信号相关，在 外 源 施 加 激 素 和 后 测 定 了 的表达情况。结果表明，与对照相比，除 处理 的 表达略有下降外，和 处理的大豆植株 均上调表达，且随着处理时间延长表达量增加（图）。表明 在大豆幼苗受 种激素的诱导表达，诱导更为强烈。生物信息学分析 克隆 使用 的特异引物从大豆品种天隆 号叶片 中获得长度为 的扩增片段（图），测序比对结果显示扩增片段与 序列一致，说明成功克隆获得 基因。第 期许建玉，等：在大豆干旱胁迫下的功能分析图 （）和（）处理下 的表达.（）（）图 的 扩增.；的 扩增条带 生物信息学分析
15、数据库显示 基因位于大豆 号染色体上，编码 个氨基酸。利用 预测结果显示其蛋白相对分子质量为，为。使用 在线软件预测发现 氨基酸序列中含有 个由 个氨基酸残基组成的 保守结构域（图），是 家族特有的结构域。利用 分析 基因结构，结果显示其不含内含子。预测结果显示 氨基酸序列中含有 个核定位信号，表明 蛋白可能定 位 于 细 胞 核 中。预 测 结 果 显 示 基因含有 个 和 保守基序（图），与其他作物中的 基因结构类似。蛋白的亚细胞定位 预测显示 可能定位在细胞核上。为了进一步明确 蛋白在植物细胞内的位置，对 蛋白进行亚细胞定位分析。构建 载体，利用农杆菌介导的瞬时表达体系分别将、蛋白与细胞
16、核 在烟草叶片中共表达。利用激光共聚焦显微镜对 荧光进行检测，当烟草中仅转化空载质粒 时，叶片表皮细胞的细胞核、细胞膜以及细胞质中均有绿色荧光分布；而转化 时，烟草叶片表皮细胞仅在细胞核部位发出绿色荧光，细胞核 的红色荧光与之融合形成黄色荧光（图），表明 定位在细胞核上，与预测结果一致，属于核定位蛋白。异源表达 对转基因拟南芥耐旱性的影响为了进一步阐明 在干旱胁迫中的作用，通过浸花法获得转基因拟南芥 代种子，经过鉴定和加代，最终获得 个纯合的异源表达 转基因 代株系，通过检测 的转录水平，选择 个 表达量最高的转基因株系 和（分别上调 和 倍）（图）。为了分析这 个株系在幼苗期对干旱处理的响应，将野生型拟南芥 和转基因株系播种在 固体培养基上，将根长为 且长势一致的幼苗转移到含不同浓度甘露醇的 固体培养基中来模拟干旱处理，后测量转基因拟南芥与野生型根系长度并进行比较。结果表明，正常条件下，异源表达 的转基因拟南芥植株与野生型植株没有明显差异；在不同浓度甘露醇处理下，转基因拟南芥的根长比野生型短（图），对干旱胁迫更敏感，且在 和 甘露醇处理下根长显著变短（图）。表明异源表达 一定程度上降
