1、第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-086文章编号:2095-1388(2023)01-0076-10斑马鱼 Notch 信号通路配体基因 delta-like 4对 smad 基因的调控作用程瑶1,2,王子睿1,2,周泽斌1,2,张鹏1,2,邱军强2,李伟明3,张庆华1,2(1.上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心,上海 201306;2.上海海
2、洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306;3.密歇根州立大学 渔业与野生生物系,美国 东兰辛 48824)摘要:为研究斑马鱼(Danio rerio)的 Notch 信号通路配体 delta-like 4(dll4)对 smad 基因(smad1 和smad7)的调控作用,利用 qRT-PCR 方法检测受精后 2 d(day post fertilization,dpf)的斑马鱼 dll4 纯合突变体 smad 家族中 smad1 和 smad7 的表达变化,利用生物信息学软件预测 smad1 和 smad7 启动子序列的转录结合位点和 CpG 岛;采用同源重组的方法
3、,构建 p3Flag-CMV-dll4 真核表达载体及 pGL3-smad1-Luc 和 pGL3-smad7-Luc 报告基因载体,并通过双荧光素酶试验检测 dll4 对 smad1 和 smad7 的调控活性;分别转染两种启动子报告基因载体到 HEK293T 细胞,共转染启动子报告基因载体与真核表达载体到 HEK293T 细胞。结果表明:dll4 纯合突变体斑马鱼中 smad1 和 smad7 表达量均显著下调(P0.000 1);两种基因启动子均包含HNF-3、GATA-1 和 Oct-1 等转录因子结合位点,只有 smad7 启动子存在 CpG 岛;报告基因 pGL3-smad1-Lu
4、c和 pGL3-smad7-Luc 的活性分别为对照组的 7.3 倍和 142.7 倍,两种报告基因与 p3Flag-CMV-dll4 表达载体共转后,转录活性均升高,分别为对照组的 2.8 倍和 2.2 倍,说明 p3Flag-CMV-dll4 可以促进 pGL3-smad1-Luc 和 pGL3-smad7-Luc 的转录表达活性。研究表明,斑马鱼 Notch 信号通路配体基因 dll4 可通过 smad 基因家族在血管生成中发挥调控作用,为损伤血管的修复和肿瘤血管生成提供特异的生物学靶点。关键词:斑马鱼;Notch 信号通路配体;delta-like 4;smad1;smad7;双荧光素
5、酶报告基因中图分类号:S 917.4;Q 71 文献标志码:A Notch 信号通路在胚胎血管形成中发挥了重要作用1。Delta-like 4(Dll4)是 Notch 信号通路的一个重要配体,对正常的血管发育至关重要2。Smad(small mothers against decapentaplegic)蛋白家族在脊椎动物的早期发育、原肠形成、造血和背腹轴形成中发挥了重要作用3,是转化生长因子(transforming growth factor-,TGF-)家族信号传导的关键下游介质。其功能除调节 TGF-、骨形态发生蛋白(bone morphogenic proteins,BMPs)、激
6、活素或抑制素等直接靶基因的转录外,还参与Notch 通路的调控,通常以细胞类型或发育阶段特异性的方式进行4。目前,已发现 8 种 Smads 蛋白家族成员,从功能角度分为 3 组:受体激活型Smad(R-Smads:Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和Smad8);通用型 Smad(Co-Smad:Smad4);抑制型Smads(I-Smads:Smad6 和 Smad7)5。TGF-可通过不同的表面受体信号刺激或抑制血管生成6,在胚胎内皮细胞中,激活素受体样激酶 1(activin receptor like kinase 1,ALK1)信号通路由其高亲和力配体BMP-9 或
7、BMP-10 激活,并由 Smad1/Smad5 介导,与 Notch 信号通路共同抑制血管生成7。研究表明,BMP/Smad 通路可以调控动物心脏发育8,小鼠中 Smad1 基因失活可导致胚胎早期死亡,主要原因是造成胚胎缺陷,包括心血管畸形9。此外,Notch 介导的心内膜细胞间的侧抑制(lateral inhi-bition)可以将 Dll4 阳性的心内膜细胞单独表达出来10。Smad7 的异位表达可有效抑制 TGF-/ALK1诱导的 Smad1/Smad5 磷酸化11,说明 BMP/Smad和 Dll4/Notch 通路对血管生成至关重要,而两者间是否具有直接调控关系值得研究。收稿日期:
8、2022-03-23 基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2019YFD0900102);教育部留学回国人员科研启动基金(D-8002-15-0042);水产动物疾病与基因编辑育种的平台建设和前沿科学研究项目(A1-3201-19-3013)作者简介:程瑶(1997),女,硕士研究生。E-mail:cyao_ cy 通信作者:张庆华(1972),女,博士生导师,教授。E-mail:qhzhang 在血管早期发育过程中,当血流触发由 Notch-Dll4 信号介导的侧向抑制时会出现流体剪切应力。对血流产生的机械力敏感的 Notch-Dll4 信号通路和Klf2-Wnt9 通路在调
9、控斑马鱼(Danio rerio)心脏瓣膜发生中存在交互作用10。研究发现,用 Morpho-lino 敲降斑马鱼 dll4 基因,会导致节间血管(inter-segment vessel,ISV)和背侧纵向吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel,DLAV)发生网状连接,破坏原有“T”型连接的表型,但具体机制尚不清楚12。本实验室利用 CRISPR/Cas9 技术得到的 dll4 基因纯合突变体斑马鱼有相同表型。最近研究发现,Epsin 15 同源结构域(Epsin 15 homology domain containing 2,EHD2)在血管
10、发育过程中可调节 Dll4 内吞作用,这对 Dll4 跨细胞增生和下游Notch 激活是必要的,在斑马鱼中敲除 EHD2 基因,可导致斑马鱼间质血管中畸形芽显著增加及下游Notch 信号减少13。而 DLL4/Notch 和 BMP9/ALK1这两种关键通路可以协同信号转导,抑制超芽生长以维持适当的血管密度7。但对于 Notch 信号通路配体 Dll4 与 Smad 蛋白的直接调控关系目前尚未见报道,猜测斑马鱼 dll4 可能通过调控 smad 基因影响节间血管与背侧纵向吻合血管的生成模式。本实验室前期研究发现,斑马鱼中 Notch 信号通路的配体基因 deltaD 可以通过调控血管内皮生长因
11、子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族中的 vegfaa 配体和 flt4 受体基因影响血管发育14。在此基础上,本研究中对斑马鱼中 Notch分子的另外一个配体基因 dll4 参与 smad1 和 smad7基因的调控进行研究,探索其对内皮细胞和新生血管分支的影响,并通过双荧光素酶试验,检测 dll4对 smad1 和 smad7 基因的调控活性,以期为 Notch信号通路调控血管的生成机制研究提供参考。1 材料与方法1.1 材料试验鱼:试验用 AB 品系野生型(wild type,WT)斑马鱼购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所斑马鱼平
12、台,dll4 纯合突变体(dll4-/-)斑马鱼由本实验室构建。斑马鱼养殖试验按照相关标准进行养殖与维护(www.zfin.org),并按照上海海洋大学动物伦理委员会的相关规定进行(SHOU-DW-2016-002)。载体及细胞:哺乳动物表达载体 p3 Flag-CMV、报告基因载体 pGL3-Enhancer 及内参质粒phRL-TK 和人胚肾细胞(human embryonal kidney,HEK293T)均由海军军医大学医学免疫学国家重点实验室李楠教授惠赠。试剂:反 转 录 试 剂 盒、同 源 重 组 试 剂 2 ClonExpress Mix 购自南京诺维赞生物科技股份(上海)有限公
13、司;Pst、BamH、Nhe 和 Xho I限制性内切酶购自 NEB 公司;DNA 聚合酶、DNA Marker 等购自 TaKaRa 公司;Trizol 试剂购自 In-vitrogen 公司;PCR 产物纯化试剂盒、海洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒和 DH5 感受态细胞均购自天根生化科技有限公司;Dual-Luciferase Reporter Assay System 及 Fu-GENE Hdjun 购自普洛麦格(北京)公司;胰蛋白酶、转染试剂 FuGENE HD Transfection Reagent、Peroxidase-Conjugated Goat
14、 Anti-Rabbit IgG(H+L)和培养基 DMEM 等均购自上海翌圣生物科技公司。重组质粒测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。1.2 方法1.2.1斑马鱼 dll4-/-中 smad1 和 smad7 基因表达量的检测 采用 Trizol 法提取受精后 2 d(day post fertilization,dpf)斑马鱼野生型及 dll4 纯合突变体整胚的 RNA,反转录获取 cDNA。然后采用罗氏480 仪器进行荧光定量 PCR 分析(qRT-PCR),并以斑马鱼的 ef1a 基因作为内参,采用 2-Ct方法计算相对表达量。qRT-PCR 引物设计见表 1。1.2.2 Dl
15、l4 氨基酸序列生物信息学分析及 smad1、smad7 启动子特征序列分析首先从 NCBI 获得12 个物种配体 Dll4 的氨基酸序列,采用 MEGA 7.0 软件,通过邻接法(NJ)构建系统进化树,并通过 iTOL 网站(https:/itol.embl.de/)和 Adobe Illustrator 软件进行进化树的美化。采用 ClustalX 软件(http:/www.clustal.org/)对斑马鱼、人和小鼠配体氨基酸相似性进行比对。采用 Methprimer-Design 软件预测斑马鱼 smad1 和 smad7 启动子的CpG 岛结构。利用 AliBaba 2.1 软件(h
16、ttp:/gene- 斑马鱼 p3Flag-CMV-dll4 真核表达载体的构建 在 NCBI 网 站 获 得 斑 马 鱼 dll4 基 因(NM_ 001079835.1)的 CDS 序列,并设计引物(表 1)。以受精后 2 dpf 的野生斑马鱼全长 cDNA为模板,用高保真酶进行 PCR 扩增。扩增体系(共 25 L):Prime STAR Max DNA Polymerase 77第 1 期程瑶,等:斑马鱼 Notch 信号通路配体基因 delta-like 4 对 smad 基因的调控作用12.5 L,DNA Template 1 L,Forward Primer 0.5 L,Reverse Primer 0.5 L,ddH2O 10.5 L。扩增条件:98 下预变性 3 min;98 下变性 10 s,65 下退火 30 s,72 下延伸 1.5 min,共进行35 个循环;最后在 72 下再延伸 5 min。然后将 PCR 产物纯化,选择酶切位点 Pst 和 BamH 将载体 p3Flag-CMV 进行双酶切并纯化。用同源重组连接酶 2ClonExpress Mix 将 P
