1、山东医药2023 年第 63 卷第 8 期靶向CD19的CAR-NK92细胞构建及其对相关肿瘤细胞的杀伤作用观察董宇曦，余卓营，冯义超，王建勋北京中医药大学生命科学学院，北京102488摘要：目的构建靶向分化群抗原19（CD19）的嵌合抗原受体（CAR）-NK92细胞，并观察其对相关肿瘤细胞的杀伤作用。方法用XhoI/NotI限制性内切酶将靶向CD19的单链抗体序列与pMFG逆转录病毒载体进行双酶切，回收纯化片段后用连接酶进行连接，构建CAR001、CAR002质粒，进行NK92细胞的转导和逆转录病毒载体的包装，构建靶向CD19的CAR-NK92细胞，分别为CAR001-NK92细胞、CAR0
2、02-NK92细胞。构建表达CD19抗原的Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP细胞。分别将NK92细胞、CAR001-NK92细胞、CAR002-NK92细胞与表达CD19抗原的肿瘤细胞共培养，分别采用流式细胞术（靶细胞为RPMI-hCD19-copGFP细胞）、荧光素酶报告基因法（靶细胞为Raji-luc细胞）和IncuCyte法（靶细胞为SW620-EGFP细胞）观察CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，采用流式细胞术观察CAR-NK92细胞对Daudi细胞增殖的影响。结果CAR001-NK92细胞、CAR002-NK92细胞的CAR表达率分别为9
3、9.0%、98.4%，CD19抗原表达率分别为99.6%、99.3%，成功构建靶向CD19的CAR-NK92细胞。Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP细胞的CD19抗原表达率分别为99.0%、100%、100%、99.5%，表达CD19抗原的肿瘤细胞构建成功。NK92细胞、CAR001-NK92细胞、CAR002-NK92细胞在不同效靶比下对RPMI-hCD19-copGFP细胞和SW620-EGFP细胞的杀伤效率依次增高（P均0.05）。CAR002-NK92细胞在不同效靶比下对Raji-luc细胞的杀伤效率均高于CAR001-NK92细胞（
4、P均0.01）。NK92组和CAR002-NK92组细胞增殖能力低于CAR001-NK92组（P均0.05）。结论成功构建的靶向CD19的CAR-NK92细胞，其对多种表达CD19抗原的肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。关键词：CD19抗原；嵌合抗原受体；NK92细胞；肿瘤细胞doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.003 中图分类号：R73 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0011-05Construction of CAR-NK92 cells targeting CD19 and its cytotoxicity against
5、tumor cellsDONG Yuxi，YU Zhuoying，FENG Yichao，WANG JianxunSchool of Life Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，ChinaAbstract：Objective To construct the chimeric antigen receptor（CAR）-NK92 cells targeting（cluster of differentiation 19）CD19 and to observe the killing effect on
6、tumor cells.Methods The synthetic sequence（single-chain fragment variable targeting CD19）was double-digested with pMFG retrovirus vector using XhoI/NotI restriction endonuception，and the purified fragment was recovered and then linked with the grafting enzyme.After successful sequencing，NK92 cells t
7、ransduction and retrovirus packaging were conducted.After titer detection，CD19-targeting CAR NK92 cells were successfully constructed，named as：CAR001-NK92 and CAR002-NK92 cells.We constructed Raji-luc，SW620-EGFP and RPMI-hCD19-copGFP cells expressing CD19 antigen as the target cells of the experimen
8、t.NK92 cells，CAR001-NK92 cells and CAR002-NK92 cells were co-cultured with tumor cells expressing CD19 antigen，respectively.Flow cytometry（target cells were PMIs-hCD19-copGFP cells），luciferase reporter gene method（target cells were Raji-luc cells），and IncuCyte method（target cells were SW620-EGFP cel
9、ls）were used to observe the killing effect of CAR NK92 cells on tumor cells.Flow cytometry was used to observe the effect of CAR-NK92 cells on proliferation of Daudi cells.Results By flow cytometry，CAR expression rates of CAR001-NK92 cells and CAR002-NK92 cells were 99%and 98.4%，respectively.CD19 an
10、tigen expression rates of the two cells were as high as 99.6%and 99.3%，and CAR-NK92 cells tar第一作者简介：董宇曦（1999-），女，硕士研究生，主要研究方向为靶向BCMA的CAR-T疗法。E-mail：通信作者简介：王建勋（1973-），男，教授，博士研究生导师，主要研究方向为现代化基因与细胞治疗手段治疗血液疾病的临床转化。E-mail：jianxun.wang 开放科学（资源服务）标识码（OSID）11山东医药2023 年第 63 卷第 8 期geting CD19 were successfull
11、y constructed.The CD19 antigen expression rates of Daudi，Raji-luc，SW620-EGFP and RPMI-hCD19-copGFP cells were 99.0%，100%，100%，and 99.5%，respectively.The tumor cells with CD19 antigen expression were successfully constructed.The killing efficiency of NK92 cells，CAR001-NK92 cells，and CAR002-NK92 cells
12、 against RPMI-hCD19-copGFP cells and SW620-EGFP cells under different effect target ratios gradually increased（P0.05）.The killing efficiency of CAR002-NK92 cells against Raji-luc cells was higher than that of CAR001-NK92 cells under different effect target ratios（P0.01）.The cell proliferation of CAR
13、001-NK92 group was higher than those of NK92 group and CAR002-NK92 group（both P0.05）.Conclusion The successful construction of CAR-NK92 cells targeting CD19 has obvious killing effect on various tumor cells expressing CD19 antigen.Key words：CD19 antigen；chimeric antigen receptor；NK92 cells；tumor cel
14、ls近年来，嵌合抗原受体（CAR）-T疗法在肿瘤相关研究领域发展迅速，CAR-T细胞在肿瘤治疗中发挥着日益重要的作用1。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤特异性抗原缺乏、低水平CAR-T细胞浸润和肿瘤抗原逃逸等因素，以及CAR-T细胞治疗可能导致靶向非肿瘤效应、神经毒性和细胞因子释放综合征（CRS）等不良反应，使得CAR-T疗法的应用受到限制2。因此，研究人员提出用NK细胞替代T 细胞表达 CAR。相对于 CAR-T 细胞，CAR-NK 细胞可以从多种来源获得，如NK92细胞系、脐带血单核细胞、外周血单核细胞及诱导的多能干细胞等3-4。CAR-NK细胞在血循环中寿命有限，对正常组织的靶向/脱靶
15、毒性风险相对较低，不易发生CRS和神经毒性，安全性更高，且不受供体患者匹配影响5-9。现阶段 CAR-NK 细胞相关研究中所使用的CAR 结构大多为 CAR-T 细胞的 CAR 结构。虽然CAR-NK细胞和CAR-T细胞杀伤肿瘤的方式相似，但它们的激活信号转导通路不同。因此，设计开发出能有效激活 NK 细胞的 CAR 结构将有助于提高CAR-NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。基于此，2021年 3月2022年 6月，本研究设计了 2种契合NK 细胞自身信号转导通路的靶向分化群抗原 19（CD19）的二代CAR结构，构建了靶向CD19的CAR-NK细胞，并观察其对多种肿瘤细胞的杀伤作用。1 材料与
16、方法 1.1实验细胞及实验试剂逆病毒包装细胞系及人骨髓瘤B细胞RPMI-8226细胞、人Burkkit淋巴瘤Daudi 细胞购于美国 ATCC 细胞库，人结直肠腺癌SW620 细胞购于国家生物医学实验细胞资源库，NK92细胞购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司，黑人Burkitt淋巴瘤Raji-luc细胞由北京维通达生物科技有限公司惠赠。RPMI1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、PBS 缓冲液、胰酶、Penicillin Streptomycin购自美国Gibco公司，FuGene HD转染试剂购自美国Promega公司，-MEM培养基、热灭活马血清购自以色列BI公司，Myc-PE、BCMA-PE、CD19-APC等抗体购自美国BD公司。人-干扰素ELISA检测试剂盒购自中国百诺威生物科技有限公司，ClonExpress Ulter One StepCloning Kit 无缝克隆试剂盒、胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、质粒纯化试剂盒、Bright-Lumi 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒、Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡检测试剂盒、病毒RNA
