1、基于 SPME 结合 GC-MS 法测定霉变烟叶中挥发性成分的研究莫 峥,杨丽莉,周 鹏,黄纲临,徐 勇,王勇军,周 萍,李 萌(红云红河烟草(集团)有限责任公司,云南昆明 650231)摘要 目的采用 SPME 富集霉变烟叶的挥发性成分,再用 GC-MS 对挥发性成分进行分离和鉴定,建立测定霉变烟叶挥发性代谢成分的方法。方法对影响 SPME 的因素(萃取头种类、萃取温度、萃取时间和解吸附时间)进行了优化,得到较优的萃取条件,并对方法的重现性进行考察;在上述条件下对样品进行测定,并对所筛选出的挥发性成分进行主成分和聚类分析。结果较优的萃取条件:采用固定相为 75 m Carboxen-PDMS
2、 涂层的黑头萃取头,在 80 下萃取样品 50 min,萃取头在气相色谱进样口的解吸附时间为 2 min。方法的重现性考察显示,6 次测定结果的 RSD 值小于 20%,说明所建立方法具有较好的重现性,满足霉变烟叶中挥发性成分的测定要求。在上述条件下对样品进行测定,从样品中鉴别出醇类、酯类、酮类和醛类等挥发性成分,霉变烟叶与正常烟叶有 8 种化合物具有明显差别,分别是 5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1,2-二甲氧基-苯、2,4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6,7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸。对所筛选出的 8 种挥发性成分的主成分和聚类分析结果表明,所筛选出的
3、 8 种挥发性成分可作为烟叶霉变的标记成分。结论该方法的开发为烟叶早期霉变的识别及有效预防提供借鉴。关键词 烟叶;霉变;挥发性成分;固相微萃取;气相色谱-质谱中图分类号 TS41+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)03-0188-04doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.03.043 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Study on the Determination of Volatile Components in Mildew Tobacco Leaves Based on SPME Combined with GC-MS
4、MethodMO Zheng,YANG Li-li,ZHOU Peng et al(Hongyun Honghe Tobacco(Group)Co.,Ltd.,Kunming,Yunnan 650231)Abstract Objective The volatile components of mouldy tobacco leaves were enriched by SPME,and then separated and identified by GC-MS to establish a method for determining the volatile metabolic comp
5、onents of mouldy tobacco leaves.MethodThe factors affecting SPME(extraction head type,extraction temperature,extraction time and desorption time)were optimized to obtain better extraction conditions,and the reproducibility of the method was investigated;under the above conditions,the samples were de
6、termined,and the selected volatile compo-nents were subject to principal component and cluster analysis.ResultOptimum extraction conditions:75 m Carboxen-PDMS for stationary phase coated black head extraction head,the sample was extracted at 80 for 50 min,and the desorption time of the extraction he
7、ad at the gas chromatography sample inlet was 2 min.The reproducibility of the method showed that the RSD value of six determinations was less than 20%,indicating that the established method had good reproducibility and met the requirements for the determination of volatile components in moldy tobac
8、co leaves.The samples were determined under the above conditions,and the volatile components such as alcohols,esters,ketones and aldehydes were identified from the samples.There were 8 compounds in moldy tobacco leaves that were significantly different from normal tobacco leaves,namely 5-methyl-2-fu
9、ran methanol,1-octene-3-ol,benzyl alcohol,1,2-dimethoxy-benzene,2,4-dichloro-1-methoxy-benzene,5-methoxy-6,7-dimethyl-benzofuran,methyl hexadecate and hexadecanoic acid.The results of principal component analysis and cluster analy-sis of the eight volatile components showed that the eight volatile c
10、omponents could be used as the marker components of tobacco mildew.Conclusion The development of this method can provide reference for identification and effective prevention of tobacco early mildew.Key words Tobacco leaves;Mildew;Volatile component;Solid phase microextraction(SPME);GC-MS基金项目 红云红河烟草
11、(集团)有限责任公司科技项目(HYHH2019-YL01)。作者简介 莫峥(1988),男,云南昆明人,工程师,从事原料仓储物流及烟叶霉变防治技术研究。收稿日期 2022-04-11;修回日期 2022-09-28 烟叶在储存过程中受微生物、温度和湿度等影响极易发生霉变。烟叶霉变使其色泽变暗,香气遗失,吃味变差,刺激性增大,使用价值降低甚至丧失,给烟草加工企业造成经济损失1,早期烟叶霉变的快速识别已成为烟草行业亟待解决的关键问题。目前霉变烟叶的研究多集中于烟叶霉变原因探索和预防措施开发,如改变环境温湿度,使霉菌不宜生长等2-3,以及研究烟叶霉变微生物4-6。但由于烟叶储存堆码的原因,即使控制仓
12、储环境的温湿度,小部分烟叶仍会霉变。烟叶霉变过程中使其挥发性代谢产物(MVOCs)发生变化,因此可通过监测烟叶霉变的挥发性代谢产物来判断烟叶霉变情况。研究显示,采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)方法检测挥发性代谢产物是一种较为理想的技术7。此技术在预测烟叶霉变报道甚少8,但在其他行业已有应用报道。在玉米霉变研究中采用挥发性成分作为霉变标记物已有报道4,9。在谷物霉变研究中已有报道,谷物在储藏过程中醇类10、酯类11、酮类12、醛类13-14、脂肪酸11等物质的变化可能导致谷物发生霉变或劣变,对谷物品质产生严重影响。因此,测定烟叶霉变前后挥发性成分测定和筛查具有重
13、要意义,可实现烟叶早期霉变的筛查,对烟叶霉变的提前预测和实时监控提供一种技术措施。该研究采用 SPME 结合 GC-MS 技术测定烟叶霉变特征标记物,建立烟叶霉变挥发性成分的测定方法,以期为霉变烟叶的识别及有效预防提供借鉴。1 材料与方法1.1 试材由云南中烟烟叶仓储库中随机抽取 4 份烟叶(包括 2 份 K326 和 2 份红花大金元烟叶,即 K326 1#、K326 2#、红大 1#、红大 2#),将各烟叶平均分为 2 份,其中一份用于后续模拟霉病试验,一份自然醇化,共计 8 份。1.2 仪器与试剂 7890B-5975B 气相-质谱联用仪,美国安捷伦(Agilent)科技有限公司;HP-
14、5MS 毛细管柱(30 m0.25 mm0.25 m),美国安捷伦(Agilent)科技有限公司;AB-204 电子分析天平,美国梅特勒(Mettler)公司;固相微萃取手柄,美国 Supelco 公司;75 m Carboxen-PDMS 固相萃取头(黑头)、85 m PDMS/DVB 固相萃取头(白头)、100 m 安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(3):188-191PDMS 固相萃取头(红头)、7 m PDMS 固相萃取头(绿头)、65 m PDMS/DVB 固相萃取头(蓝头)、30 m PDMS/DVB固相萃取头(黄头),美国 Supelco 公司;2
15、2 mL 顶空瓶,美国安捷伦(Agilent)科技有限公司;LIDA 加热搅拌台,广东科力达仪器有限公司;LHS 恒温恒湿箱,上海一恒科技有限公司;萘,99%,美国百灵威科技有限公司;乙醇,色谱纯,美国迪马公司。萘内标溶液:取 0.100 g 萘用乙醇自主配制成浓度为100 g/mL 的内标溶液。1.3 GC-MS 条件1.3.1 气相色谱条件。进样口温度 280,载气为 He,流速为 1 mL/min;升温程序:初始温度 50 (保持 2 min),以5 /min 升温至140(保持1 min),再以10 /min 升温至280(保持 1 min)。1.3.2 质谱条件。离子源为 EI 源,
16、电子能量为 70 eV,质量扫描范围为 35350 amu。1.4 数据检索 采集的质谱数据经 NIST 标准谱库进行检索并鉴定,采取峰面积归一化法计算各物质的相对含量。1.5 烟叶样品制备 模拟烟叶自然霉变,将仓储烟叶放在恒温恒湿箱中,在适宜温湿度条件下(温度为 28、相对湿度为 60%)进行霉变试验,放置 21 d 后,得到霉变烟叶。将对应的正常烟叶与霉变烟叶分别置入旋风磨中,粉碎过 40目筛,备用。1.6 试验方法 选取红花大金元同一份正常烟叶为对象;每次称取 0.5 g 烟叶粉末样品置于 22 mL 顶空瓶中,同时在顶空瓶中加入 10 L 浓度为 100 g/mL 的萘作为内标,及时封盖后将顶空瓶放置于加热搅拌台。将萃取头插入 GC 进样口于 300 老化 1 h,直至无杂峰出现,并对条件进行优化:对萃取头种类(黑头 75 m Carboxen-PDMS、黄头30 m PDMS/DVB、白 头 85 m PDMS/DVB、绿 头 7 m PDMS)的优化;对萃取温度(50、60、70、80、90)的优化;对萃取时间(30、40、50、60 min)的优化;对解吸附时间(1、2、
