1、 年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 亳州市科技重大专项（）；年全国中药特色技术人才培训项目（）；安徽省重点研究与开发计划项目（）通信作者 谢冬梅，副教授，主要从事中药资源开发与中药质量评价研究，：（），：；刘丛彬，副教授，主要从事中药化学成分分离与鉴定研究，：作者简介 杨爽，硕士研究生，：（），：基于 和 的不同品种白芍主要化学成分分析杨爽，杜倩倩，岳倩侠，孙叶芬，金传山，张伟，马磊，刘丛彬，谢冬梅，（安徽中医药大学，安徽 合肥；安徽省中医药研究院 中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥；安徽济人药业股份有限公司，安徽 亳州）摘要应用超高液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（）技术结合多元
2、统计分析药材白芍的不同栽培品种的药用部位中主要化学成分的异同性；建立高效液相色谱法（）同时测定白芍中 种活性成分的方法。采用 色谱柱（.，.），柱温 ，.甲酸水溶液（）乙腈（）为流动相，梯度洗脱，流速.；电喷雾离子源，正、负离子模式下采集质谱数据，其中正、负离子模式下鉴定了不同栽培品种白芍根中的 种主要相同成分，负离子模式筛选并鉴定了 种含量显著性差异成分，种“亳白芍”中特有成分。采用 进行定量分析，使用 色谱柱（.，），柱温 ，.磷酸水溶液（）乙腈（）为流动相，梯度洗脱，流速.，检测波长，建立了 同时测定白芍根中 种活性成分（没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、
3、，五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷）的含量测定方法，各成分的线性关系良好（.），精密度、重复性和稳定性良好，平均回收率为.，为.（）。为鉴定白芍的化学成分提供了一种快速、高效的定性分析方法；所建立的 同时测定 个活性成分含量的方法简便、快捷、准确，为不同栽培品种白芍的种质资源和药材质量评价提供了科学依据。关键词 白芍；品种；质量评价 ，（，；，；，），（）；，（）（.年 月第 卷第 期.，.，.）.（）（）.，；，（）（.，）.（）（）.（，）（.），.（），；：.中药白芍 主产于安徽亳州（亳白芍）、浙江杭州（杭白芍）、四川中江（川白芍）及山东菏泽（菏泽白芍）等地。在安徽亳州及其周边地区，白芍的
4、栽培品种主要为“线蒲”“线条”“蒲棒”等 个传统“亳白芍”品系，不同品系来源的白芍药材有效成分高低存在一定差异。近年来，一些药农又新引进了一种“杂花白芍”品种，其根部加工后与“亳白芍”药材的性状特征极为相似，与“亳白芍”质量比较未见报道。因此有必要对不同品种白芍的药用部位中化学成分的异同性进行比较分析。超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（）具有高分辨率、高质量准确度、高灵敏度等特性，广泛用于中药材不同产地、不同品种、不同药用部位中代谢物或化合物的差异性的鉴别分析。研究表明，白芍中主要含有单萜苷类、鞣质类、有机酸类、黄酮类等成分，其中单萜苷类成分芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和
5、没食子酰芍药苷具有调节肝功能、改善心脑血管功能和治疗类风湿性关节炎等作用，鞣质类成分，五没食子酰葡萄糖和有机酸类成分没食子酸具有抗炎镇痛、抑菌和保护心脑血管等作用，而黄酮类成分儿茶素则具有抗氧化、改善脂质代谢异常、预防和治疗心血管疾病等作用。因此，本研究采用 技术对不同品种白芍的主要和差异成分进行鉴定，并在此基础上，采用高效液相色谱法（）同时测定不同品种白芍中上述 种活性成分的含量，为科学评价不同白芍栽培品种的质量差异性提供科学依据。材料.仪器 （美国 公司）；高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；超纯水净化系统（美国 公司）；型十万分之一电子天平（美国 公司）；型超声波清洗器（合肥金尼克机械制造
6、有限公司）；冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；型高速冷冻离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司。.药物与试剂对照品没食子酸（批号）、芍药内酯苷（批 号 ）、苯 甲 酰 芍 药 苷（批 号）、芍药苷（批号）、儿茶素（批号）均购自武汉天植生物技术有限公司；原儿茶醛（批号）、氧化芍药苷（批号）、，五没食子酰葡萄糖（批号）、苯甲酸（批号）、牡丹皮苷（批 号）、苯 甲 酰 氧 化 芍 药 苷（批 号）、没食子酰芍药苷（批号）、没杨爽等：基于 和 的不同品种白芍主要化学成分分析食子酸甲酯（批号）均购自成都普思生物科技有限公司；丹皮酚（批号）购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸（批号）购自北京亿诺辉
7、科技发展有限公司；所有对照品纯度均大于。质谱纯甲醇（瑞典 公司）；质谱纯乙腈（美国 公司）；色谱纯甲酸（天津市光复精细化工研究所）；其他试剂均为分析纯。.样品本研究所用样品于 年 月采自于安徽省亳州市，依据课题组前期对栽培品种生长期的观察、根的性状等特征，经安徽中医药大学金传山教授鉴定为毛茛科芍药 栽培品种“线蒲”“线条”“蒲棒”和“杂花白芍”，见表。鲜品洗净，置 冰箱保存。表 白芍样品信息 样品编号品种采集地年限分组线蒲亳州市协和成药业种质圃线条亳州市协和成药业种质圃线条安徽济人药业种植基地蒲棒亳州市谯城区观堂镇杂花白芍安徽济人药业种植基地 方法与结果.定性分析.供试品溶液的制备不同栽培品种
8、的根经真空冷冻干燥后粉碎，过 目筛。取供试品粉末.，精密称定，置 锥形瓶中，精密加入 甲醇 ，称重，超声提取 （，），取出放冷，称重，以 甲醇补足失重，摇匀，离心 ，取上清液过.微孔滤膜，取续滤液，即得。.对照品溶液的配制精密称取没食子酸、原儿茶醛、芍药内酯苷、氧化芍药苷、，五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、芍药苷、苯甲酸、儿茶素、牡丹皮苷、苯甲酰氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚、原儿茶酸对照品适量，以甲醇溶解，分别配制成质量浓度为.的单一对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，置于同一量瓶中，制成混合对照品溶液。.色谱条件 色谱柱（.，.），流动相为.甲酸水溶液（）乙腈（），
9、梯度洗脱（，；，；，；，；，；，；，；，；，；，；，）；柱温 ；流速.；进样量 。.质谱条件采用电喷雾离子源（），正、负离子模式检测，毛细管电压.，锥孔电压 ，低能量时碰撞电压 ，高能量时碰撞电压 ，去溶剂化温度 ，离子源温度 ，去溶剂化气体流量 ，锥孔气体流量 ，扫描时间 ，扫描范围 。.数据处理使用 .软件完成数据采集；借助 科学信息系统，根据高分辨质谱测得的精确相对分子质量；通过分析各成分的保留时间、特征碎片离子峰，结合文献中报道的化合物裂解规律、同条件下对照品的裂解规律和、等在线数据库，对化合物进行识别鉴定。多元统计分析：质谱原始数据的预处理采用 软件，完成峰匹配、峰提取和归一化等过程
10、。设置 .和最大倍数变化（）为筛选条件过滤化合物，将处理后的数据导出到 .软件，结合主成分分析（）、正交偏最小二乘法判别分析（）、变量重要性投影（）等方法，获得差异性化合物。.不同品种总离子流图（）比较在负离子模式下，各组样品的总离子流图响应值较高、分离度较好，见图。研究表明，各组样品的总离子流谱图相似度较高，说明不同栽培品种的根中主要化合物种类基本一致；部分色谱峰的离子强度有较大差别，说明所含成分的含量可能存在差异。.相同化学成分的分析在正、负离子模式下，共推测和鉴定了 种主要化合物，见表。包括单萜及其苷类化合物 年 月第 卷第 期.，.，线蒲（）；线条（）；线条（）；蒲棒（）；杂花白芍（）
11、。图 总离子流图.种，有机酸类化合物 种，鞣质类化合物 种，黄酮类化合物 种，挥发油类 种，三萜类化合物 种。.差异性化学成分的筛选及鉴定将质谱采集的总离子流谱图导入 软件，转换成 离子强度图，经对齐和处理后，在.项下的条件过滤；将包含保留时间、质荷比（）和离子强度等数据矩阵导入 .软件，以进行下一步的分析。使用无监督的 评估样本的分类趋势和组间差异，模型的 .，.，表示该模型稳定可靠。结果显示，在下，栽培“亳白芍”的 个品系“蒲棒”“线蒲”“线条”根中主要化学成分分离度较好，相似度较高，且明显不同于“杂花白芍”，见图。为探究 种品系“亳白芍”（）与“杂花白芍”（）化学成分的差异，运用有监督的
12、 进行二维数据分析，见图。模型的.，.，.，表明所建模型可信度高、预测能力强。可以看出，和 明显分成 组，提示两者存在显著差异。对 进行验证，设定随机排列检验次数为 次，模型的 和 与 轴截距分别为.、.，说 明 模 型 预 测 能 力 好；而 散 点 得 分 图（）可以表示组间的差异成分，数据点离原点越远，则该变量对样本分组差异的贡献越大，利用 图可筛选出存在显著性差异（）的代谢物，见图、。根据差异代谢物的 及保留时间等信息，将该数据与成分鉴定结果或数据库匹配，共筛选鉴定了 种差异性成分，质谱数据见表。.同时测定 种活性成分.供试品溶液的制备取新鲜根，经真空冷冻干燥，粉碎后过 目筛。取供试品
13、粉末.，精密称定，置于 量瓶中，精密加入乙醇，超声提取（，），取出放冷，以 乙醇定容至刻度，摇匀，经.微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。.对照品溶液的制备分别精密称取没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、，五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，置于同一量瓶中，以甲醇溶解，配制成质量浓度分别为.、.、.、.、.、.、.、.的混合对照品储备液。.色谱条件采用 色谱柱（.，）；流动相为.磷酸水溶液（）乙腈（），梯度洗脱（，；，；，；，；，）。检测波长 ；流速 ；柱温 ；进样量 。色谱图见图。.方法学考察.标准曲线绘制取.项下混合对照杨爽等：基于 和 的不同品种白芍主要化学
14、成分分析 表 白芍主要化学成分鉴定 理论值实测值离子形式特征碎片离子（）误差 分子式化合物鉴定参考文献.，.蔗糖.，.，.，.去苯甲酰基芍药苷或异构体.，.，.，.，.，.，.，.，.去苯甲酰基芍药苷或异构体.，.没食子酸）.，.，.牡 丹 酮葡萄糖苷或异构体，.原儿茶酸）.，.，.牡丹皮苷，.原儿茶醛）.，.牡丹皮苷，.，.，.，.氧化芍药苷同分异构体，.，.没食子酸甲酯）.，.，.，.，.，.儿茶素）.，.，.，.，.氧化芍药苷）.，.，.，.，.，.，三 没 食子酰葡萄糖，.，.，.，.牡丹皮苷.，.，.，.芍药内酯苷）.，.，.，.芍药苷）.，.，.，.，.没食子酸乙酯.，.，.，.鞣
15、花酸，.，.，.，.，.，.，四没食子酰葡萄糖或异构体，.，.苯甲酸）.，.，.，.，.，.，四没食子酰葡萄糖或异构体，.，.，.，.，.，.，.没食子酰芍药苷）.，.，.，.，.没食子酰芍药苷同分异构体 年 月第 卷第 期.，.，续表 理论值实测值离子形式特征碎片离子（）误差 分子式化合物鉴定参考文献.，.，.，五没食子酰葡萄糖）.，.，.，.，.没食子酰芍药苷同分异构体.，.，.，.，.牡丹皮苷，.，.，.，.，.，.，.，.，.牡丹皮苷）.，.，.，.，.牡丹皮苷，.，.，.，.，.，.苯甲酰氧化芍药苷）.，.，.，.，.，.苯甲酰芍药苷）.，.丹皮酚）.，.，.，.苯甲酰芍药苷同分异构
16、体.，.，.牡丹皮苷.芍药二酮 注：未检测到；）经对照品比对。得分图；图；模型交叉验证图；图（.的成分已用红色三角形标记）。图 负离子模式的多元统计分析.杨爽等：基于 和 的不同品种白芍主要化学成分分析表 不同品种白芍的差异性化合物鉴定 实测值分子式化合物鉴定来源组别.去苯甲酰基芍药苷或异构体.、.、.去苯甲酰基芍药苷或异构体.、.没食子酸.、.牡丹酮葡萄糖苷或异构体.、.牡丹皮苷.、.牡丹皮苷.、.氧化芍药苷同分异构体.、.儿茶素.、.氧化芍药苷.、.牡丹皮苷.、.芍药内酯苷.、.芍药苷.、.，四没食子酰葡萄糖或异构体.、.没食子酰芍药同分异构体.、.牡丹皮苷.、.苯甲酰芍药苷.、注：亳白芍；杂花白芍。没食子酸；氧化芍药苷；儿茶素；芍药内酯苷；芍药苷；没食子酰芍药苷；，五没食子酰葡萄糖；苯甲酰芍药苷。图 混合对照品、供试品的 图.品溶液，以甲醇稀释，稀释倍数为、倍，得到不同浓度的对照品溶液，混匀后滤过，按照.项下色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标（），对照品质量浓度（）为横坐标（）绘制标准曲线，各成分的回归方程、相关系数、线性范围见表。.精密度试验精密称取样品（）.，按.项下方法制备
