1、2023 年 2 月第 44 卷第 1 期河南工业大学学报(自然科学版)Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition)Feb.2023Vol.44 No.1收稿日期:2022-01-21基金项目:国家粮食和物资储备局粮油食品工程技术研究中心开放课题(GA2018007)作者简介:李博聪(1998),男,辽宁辽阳人,硕士研究生,研究方向为食品分析新技术。通信作者:向国强,博士,教授,E-mail:。基于碳量子点的水果中-葡萄糖苷酶活性测定方法研究李博聪,黄高,苏柯,李俊丽,闫新雨,何梦瑶,江秀明,何丽君,向国强
2、河南工业大学 化学化工学院,河南 郑州 450001摘要:荧光法测定-葡萄糖苷酶(-D-glucosidase,-Glu)活性具有简单、灵敏的特点,探索荧光法测定-Glu 活性的新方法具有重要意义。以茶汤(柑普茶)为碳源,通过自放热反应快速制备碳量子点(carbon dots,CDs),以其为荧光探针,基于荧光内滤效应建立了-Glu 活性的新方法。结果表明:所制备的 CDs 具有类石墨结构,粒径约 4.5 nm,主要含有 C、O、N 等元素;CDs 的最佳激发波长 320 nm,最佳发射波长 385 nm。将对硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)加入 CDs 溶液中,能引起 CDs
3、 的荧光强度明显降低,且 CDs 荧光猝灭程度 lg(I0/I)与 p-NP 浓度呈线性关系,基于此建立了一种定量分析 p-NP 的方法。利用对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)在-Glu 催化作用下产生 p-NP,通过荧光猝灭作用测定 p-NP 浓度可间接测定-Glu 活性。该方法的检出限为 0.074 U/L,线性范围 0.120 U/L。研究发现,CDs 的发射谱带(385 nm)与 p-NP 在 400 nm 处的吸收峰有较大光谱重叠,且 CDs 的荧光寿命在加入 p-NP 后没有明显的变化,表明 p-NP 对 CDs 的荧光猝灭机理为内滤效应。实际样品分析表明该方法简便、快速、
4、灵敏,可应用于水果中-Glu 活性的测定。关键词:茶汤;碳量子点;-葡萄糖苷酶;酶活性;对硝基苯酚中图分类号:TS201.2文献标志码:A文章编号:1673-2383(2023)01-0082-07DOI:10.16433/j.1673-2383.2023.01.011A new method for the determination of-glucosidase activity in fruits based on carbon dotsLI Bocong,HUANG Gao,SU Ke,LI Junli,YAN Xinyu,HE Mengyao,JIANG Xiuming,HE Lij
5、un,XIANG GuoqiangCollege of Chemistry and Chemical Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,ChinaAbstract:Fluorometry for the determination of-D-glucosidase(-Glu)activity is simple and sensitive,and a new fluorometry method for the determination of-Glu activity was explored.Carbon
6、 Dots(CDs)were prepared by self-exothermic reaction using tea infusion(Gampucha)as carbon source.Based on the inner filter effect(IFE),a novel method for the determination of-Glu activity was established using CDs as fluorescent probe.The results indicated that the prepared CDs had a graphite-like s
7、tructure with a particle size of 4.5 nm and were mainly composed of C,O,N atoms.The maximum excitation and emission wavelength of CDs were 320 nm and 385 nm respectively.When p-nitrophenol(p-NP)was added to the CDs solution,the fluorescence intensity of CDs decreased significantly,and there was a go
8、od linear rela-tionship between the degree of fluorescence quenching lg(I0/I)and the concentrations of p-NP.Based on the linear response,a new analytical method for p-NP was developed,and p-NP is the hydrolysis product of p-nitrophenyl-D-glucopyranoside(p-NPG)in the presence of-D-glucosidase.Therefo
9、re,the activity 第 44 卷第 1 期李博聪,等:基于碳量子点的水果中-葡萄糖苷酶活性测定方法研究of-Glu could be obtained indirectly by quantitative results of p-NP.The detection limit of this method was 0.074 U/L with a linear range of 0.1-20 U/L.It was found that there was a large overlap between the fluorescence emission band(385 nm)of
10、 CDs and the absorption peak of p-NP(400 nm),and the flu-orescence lifetime of CDs did not change significantly after the addition of p-NP,suggesting that the fluo-rescence quenching mechanism of CDs by p-NP was IFE.The developed method was simple,sensitive,and rapid,and could be applied in the dete
11、rmination of-Glu activity in fruits.Key words:tea infusion;carbon dots;-glucosidase;enzyme activity determination;p-nitrophenol生物酶参与生物体内的各种代谢过程,低浓度酶的监测对于研究酶的生物功能至关重要,也能提高与酶有关的疾病诊疗水平1-3。糖苷酶是催化糖苷水解的酶,种类较多,分别作用于含有不同糖苷键的底物4。葡萄糖苷酶主要分为-葡萄糖苷酶(-Glu)和-葡萄糖苷酶(-Glu)。-Glu 催化-D-吡喃葡萄糖苷的水解,而-Glu催化水解二糖和其他含葡萄糖分子中的-葡萄
12、糖苷键释放葡萄糖5。-Glu 在哺乳动物(包括人类)、微生物、植物和土壤中大量存在,在生物过程中发挥重要作用4。-Glu 参与哺乳动物中神经酰胺的水解,控制-Glu 活性的基因缺陷与人类的高雪氏症有关6。-Glu 活性常用来识别生物体内的变化,是新生儿坏死性小肠结肠炎早期诊断的有效生物标志7。由益生菌产生的-Glu 可从大豆产品中的糖基化类黄酮中去除糖苷部分,使类黄酮通过肠道吸收,有益人类健康8。-Glu 在生物转化和改善果汁、葡萄酒风味方面也起着重要作用9。因此,开发灵敏、可靠的-Glu 活性测定方法十分必要。测定-Glu 活性的方法有很多种,传统的测定方法是基于人工底物对硝基苯基-D-吡喃
13、葡萄糖苷(p-NPG)对对硝基苯酚(p-NP)转化,然后通过分光光度法进行定量10,这种方法的最大不足是底物非常不稳定且用到大量有害试剂11。荧光法测定酶活性具有响应快、灵敏度高、样品处理过程简单等优点,近年来受到越来越多的关注12。检测-Glu 活性的荧光法陆续被开发出来,这些方法涉及荧光底物,但有机染料底 物 合 成 复 杂,在 水 中 的 溶 解 性 差6,13。碳基纳米荧光探针已被广泛应用于生物分子的快速、灵敏的检测14-15,包括酶活性的测定,如-葡萄糖苷酶、-L-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶16-18。在碳基纳米材料中,碳量子点(CDs)因其制备成本低、化学惰性好、光学性
14、能好、细胞毒性低等优点而受到了广泛的关 注。大 多 数 的 CDs 是 通 过 水 热 法制 备的19,这种方法需要消耗大量的能量和时间。快速、高效、低成本制备 CDs 一直是 CDs 研究的重要内容之一,所制备的 CDs 荧光量子产率不高也是限制其分析应用的重要因素。利用 CDs的简单易得、良好的溶解性和荧光性质,建立新的高灵敏、高选择性生物分析方法是 CDs 的重要发展方向。作者以柑普茶茶汤为碳源,在无外加热源的条件下,通过自放热反应快速、高效制备了蓝色荧光的 CDs。在-Glu 作用下,底物 p-NPG 水解产物之一是 p-NP。基于 p-NP 对 CDs的荧光内滤效应(inner fi
15、lter effect,IFE)建立了-Glu 活性测定的荧光分析新方法,并成功应用于水果中-Glu 活性的测定。1材料与方法1.1材料与试剂柑普茶(小青柑):广东省江门市新会。冬枣、香梨和红提(产地新疆)均购于郑州高新区永辉超市。蔗糖(Sur)、乳果糖(Lac)、葡萄糖(Glc)、D-果糖(Fru)、D-甘露糖(Man)、-乳糖(-Lac)、L-赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys):阿拉丁试剂(上海)有限公司;H2O2、二乙烯三胺(DETA)、p-NP、碳酸钠、-Glu(100 U/g)、对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及其他金属盐:中
16、国医药集团。采用 Britton-Robison(BR)缓冲溶液控制溶液的pH 值,所用化学试剂均为分析纯,使用前未进行纯化处理。1.2仪器与设备JEM-2011 透射电子显微镜:日本电子株式会社;Escalab 250Xi XPS 光 电 子 能 谱 仪:美 国Thermo Fisher 公司;RF-6000 荧光分光光度计、UV-2600 紫外-可见分光光度计:日本 Shimadzu公司;WQF-510 傅里叶变换红外光谱仪:北京瑞利分析仪器有限公司;FL-TCSPC 荧光分光光度38河南工业大学学报(自然科学版)2023 年计:法国 HORIBA Jobin Yvon 公司;Molecular 分析型 1040D 纯 水 机:重 庆 摩 尔 水 处 理 设 备 有 限公司。1.3CDs 的制备CDs 的制备在本课题组前期工作20基础上稍加改进,利用 H2O2在碱性条件(DETA)下发生分解反应放出的热量,对碳源进行热裂解,从而达到制备 CDs 的目的。取小青柑 1 颗(约 10 g)放入 250 mL 烧杯中,加入 100 mL 沸水浸泡,待冷却至室温后,过滤得到茶汤。取 1.7
